Comparing different methods to measure biofilm thickness: the techniques are: optical coherence tomography, confocal laser scanning microscopy and low load compression test

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)

Biofilm formation remains a serious concern in industry and in the medical field. They are responsible for huge economical losses in many industrial sectors and for serious infections associated with biomaterial implants and medical devices. These infections are hard to treat because bacteria within the biofilm are more resistant to antibiotics and to the host immune system. Therefore, studying biofilm properties and mechanisms is of utmost relevance to develop efficient approaches to deal with this drawback. Biofilm thickness is an important parameter in biofilm characterization. The main purpose of this thesis was to assess the suitability of Optical Coherence Tomography (OCT) to measure biofilm thickness by comparing the results with the values obtained with the Low Load Compression Test (LLCT) and Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM). OCT is a nondestructive technique, which is increasingly applied on the medical field and allows the acquisition of images in real-time, in situ and with high resolution. Biofilms were grown onto glass slides and the measurements were done in the following order: first OCT, since it is a non-destructive technique, second LLCT and last CLSM. In order to study if slime could influence the measurements, different strains and bacteria exhibiting distinct extracellular polymeric substance (EPS) production capacities were used. Staphylococcus aureus ATCC 12600 is an EPS producer, while Staphylococcus aureus 5298 is not and Streptococcus mutans use extracellular glucans in the presence of sucrose to build its protective matrix, so different treatments with different percentages of sucrose were used in the growth medium during biofilm development. The results obtained proved that OCT is suitable to measure biofilm thicknesses and the presence of slime does not influence the results. In contrast, LLCT measurements showed to be affected by slime and biofilm density. CLSM showed limitations relatively to stain and laser penetration. Additionally, the results obtained emphasize the potential applicability of OCT to investigate the mesoscopic structure of the biofilm.

A formação de biofilmes é um problema sério na industria e na área médica, sendo responsáveis por enormes prejuízos económicos em muitos sectores industriais e por sérias infeções associadas a implantes e dispositivos médicos. Estas infeções são difíceis de tratar, visto que as bactérias quando presentes no biofilme ganham maior resistência a antibióticos e ao sistema imunitário. Por este motivo, estudar as propriedades e mecanismos dos biofilmes é de extrema importância para conseguir desenvolver abordagens eficazes que permitam ultrapassar estes problemas. A espessura dos biofilmes é um parâmetro importante para a sua caracterização. O principal objectivo desta tese foi avaliar a adequação do OCT para medir a espessura dos biofilmes, comparando os resultados com os valores medidos com o LLCT e CLSM. O OCT é uma técnica não destrutiva que tem sido utilizada na área da medicina e permite a aquisição de imagens em tempo real, in-situ e com elevada resolução. Os Biofilmes cresceram em lâminas de vidro e as medições foram feitas na seguinte ordem: primeiro OCT, visto ser uma técnica não destrutiva, seguido do LLCT e por fim o CLSM. Neste trabalho também foi estudado se a presença de EPS pode influenciar as medições em alguma destas técnicas. Para isso foram utilizadas diferentes bactérias e estirpes com capacidades distintas de produção de matrizes extracelulares. A Staphylococcus aureus ATCC 12600 tem capacidade de produzir EPS naturalmente, ao contrário da Staphylococcus aureus 5298. Por outro lado a Streptococcus mutans usa glucanos extracelulares para construir a sua matriz extracelular quando o meio de crescimento possui sacarose. Deste modo foram utilizadas diferentes percentagens deste glícido com o objectivo de obter diferentes tipos de matrizes. Os resultados obtidos provam que o OCT é uma técnica que pode ser usada para medir a espessura de biofilmes. Por outro lado as medições obtidas pelo LLCT são afectadas pela matriz extracelular dos biofilmes e pela sua densidade. O CLSM mostrou limitações relativas a capacidade de penetração do laser e dos corantes. Adicionalmente os resultados obtidos sublinham o potencial do OCT para estudar a estrutura do biofilme ao nível da mesoescala.