Desenvolvimento de bionanoconjugados com nanopartículas de ouro e oxidases para a detecção de poluentes ambientais

Dissertação para a obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

O presente estudo teve como principal objectivo o desenvolvimento de um biossensor baseado em Tirosinase, com a conjugação de nanopartículas de ouro, para a detecção de pesticidas. O objectivo secundário foi verificar se os bionanoconjugados de Tirosinase e nanopartículas de ouro com diferentes agentes de revestimento, aumentavam a eficiência catalítica da Tirosinase,comparativamente com a enzima livre. Os ensaios em solução da actividade da Tirosinase livre e em bionanoconjugados, com diferentes agentes de revestimento – Citrato, ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA) e o pentapéptido CALNN, numa gama de pH dos 4-8, permitiram concluir que a pH 4 e 5 a Tirosinase livre possui uma maior eficiência catalítica do que qualquer dos bionanoconjugados. Já a pH 6, 7 e 8 o bionanoconjugado revestido com CALNN é o que possui maior eficiência catalítica quando comparado com os restantes bionanoconjugados e Tirosinase livre, aumentando a actividade da Tirosinase em 26% a pH 6, em 6% a pH 7 e em 11% a pH 8. O biossensor de Tirosinase desenvolvido efectua a reacção de oxidação de compostos fenólicos a quinonas. A detecção de pesticidas é efectuada através da inibição da actividade de Tirosinase. O biossensor de Tirosinase foi desenvolvido sobre um eléctrodo de óxido de estanho dopado com fluoreto (FTO), à sua superfície foram sintetizadas nanopartículas de ouro por electrodeposição, com adição posterior de uma camada auto-montada de ácido 3-Mercaptopropanóico, que permitiu a ligação covalente da Tirosinase ao elétrodo por cross-linking com a ajuda dos compostos 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida/ N-Hidroxisuccinamida. O biossensor foi caracterizado por microscopia electrónica de varrimento (SEM) e espectroscopia fotoelectrónica de Raio-X (XPS). Foi possível concluir que a electrodeposição do ouro ocorre com a formação de nanopartículas sobre o eléctrodo de forma uniforme sobre toda a sua área e a ligação da Tirosinase ao eléctrodo ocorre especificamente nas zonas do eléctrodo com nanopartículas de ouro e ácido 3-mercaptopropanóico sobre as mesmas. O composto fenólico seleccionado como substrato da Tirosinase foi o catecol. Para concentrações deste substrato superiores a 150 μM, determinou-se a ocorrência de inibição suicida da enzima, nas condições experimentais ensaiadas. A monitorização da reacção de oxidação de catecol com o biossensor desenvolvido foi efectuada com sucesso. Os resultados de voltametria cíclica com adição de pesticida (ácido 2,4 – diclorofenoxiacético(2,4-D)) permitiram concluir que a gama de concentrações detectável pelo biossensor desenvolvido é de 0,018-0,7 ng/mL, com uma inibição gradual do biossensor entre os 15 e 65 % de analito. O biossensor apresentou ainda um limite de detecção (LOD) de 0,0329±0,0144 ng/mL e uma concentração de saturação de aproximadamente 1 ng/mL para o analito em estudo.