O citocromo b5 no complexo enzimático do citocromo P450

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Estudos anteriores indicaram que o b5 tem diferentes efeitos no complexo enzimático do CYP, dependendo do tipo de substrato e da forma de CYP envolvida. Para uma melhor compreensão do b5 no complexo enzimático do CYP, este trabalho pretendeu estudar o mecanismo de actuação e efeito do b5 no referido complexo. Para este fim, utilizamos um sistema bacteriano biplasmídico que permite a co-expressão de um CYP com a CYPOR na presença ou ausência de b5. Seleccionámos dois CYPs, o CYP1A2 e o CYP2A6, uma vez ter sido demonstrado que a presença de b5 exerce um forte estímulo sobre a actividade catalítica do CYP2A6, e que o CYP1A2 aparenta uma relativa insensibilidade à presença desta proteína. Como se pensa que o b5 actua sobre a eficiência da transferência de electrões da CYPOR para o CYP, escolheram-se duas variantes da CYPOR relacionadas com a Síndrome de Antley-Bixler, nomeadamente Y459H e Y181D, as quais contêm mutações que causam a debilitação da ligação dos grupos prostéticos FAD e FMN respectivamente, grupos directamente envolvidos na capacidade de fornecer electrões ao CYP. Após a validação dos diferentes sistemas bacterianos construídos, estes foram aplicados em duas abordagens ao estudo do b5 no complexo enzimático do CYP, nomeadamente a influência do b5 na capacidade do CYP1A2 e CYP2A6 para bioactivar mutagénios e, numa abordagem cinética, avaliando a actividade destes dois CYPs, utilizando substratos padrão. Os resultados indicaram que há uma competição da CYPOR e do b5 pelo sítio de ligação ao CYP, bem como da CYPOR e doo sistema redox bacteriano Fld/FdR. Foi também demonstrado que o b5 está envolvido no aumento da eficiência da transferência do segundo electrão para o CYP e consequente diminuição do desacoplamento, tornando a reacção mais eficiente. Verificou-se um maior efeito competitivo do b5 quando na presença da variante Y181D da CYPOR, que nos permite sugerir que a CYPOR-Y181D tem menor afinidade para o CYP, relativamente à CYPOR-Y459H e CYPOR consensual, indicando a importância do resíduo Y181 na interacção proteína-proteína no complexo CYPOR-CYP. Estas deduções são mais fortemente apoiadas pelos resultados provenientes dos estudos da bioactivação do que pelos estudos de cinética enzimática.