Estudos estruturais em ferredoxinas por ressonância magnética nuclear

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Química, especialidade Química Inorgânica, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

As ferredoxinas são proteínas de baixo peso molecular que contêm agregados [Fe-S] do tipo [3Fe-4S], [4Fe-4S], [3Fe-4S] + [4Fe-4S] e 2 x [4Fe-4S], podendo ser utilizadas como compostos modelo na investigação das propriedades electrónicas, paramagnéticas e estruturais de agregados [Fe-S] em enzimas complexas. A ferredoxina II (FdII) isolada da bactéria redutora de sulfato Desulfovibrio gigas (Dg) é uma proteína tetramérica de transferência electrónica com 58 resíduos de amino ácidos(seis cisteínas), que contém um centro [3Fe-4S] coordenado por três ligandos cisteicos; Cys 8,Cys 14 e Cys 50, e uma ponte dissulfureto entre os resíduos Cys 18 e Cys 42. A caracterização tanto bioquímica como espectroscópica recorrendo nomeadamente à espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 10 e 20, em conjunção com outras técnicas espectroscópicas, tais como a Ressonância Paramagnética Electrónica, UV/Vísivel e Mõssbauer foi já realizada para o estado oxidado desta proteína, de forma a compreender as suas propriedades redox e electrónicas. Durante o estudo do comportamento redox desta proteína foi descoberto um intermediário, DgFdIIinb originado pelo abertura da ponte dissulfureto. Devido à sua estabilidade, e utilizando as mesmas técnicas já utilizadas anteriormente para o estado oxidado, foi possível obter a sua caracterização. São assim apresentadas as atribuições específicas das ressonâncias pertencentes aos protões I3-CHz dos resíduos cisteicos,coordenantes e a análise da dependência angular das mesmas, possibilitando juntamente com as coordenadas de raios-X para o estado oxidado, uma comparação dos ângulos diedros entre os estados oxidado e intermediário da DgFdlI. Foi também introduzido um novo modelo de acoplamento de spins para o estado intermediário de modo a obter valores para as constantes de acoplamento, J dos átomos de ferro do agregado metálico. A existência de um quarto sítio desocupado no agregado [3Fe-4S] (Cys 11), abre a possibilidade da inserção de um quarto átomo metálico. Foi assim sintetizado o agregado misto [Co, 3Fe-4S] para o qual foi realizada uma breve análise espectroscópica, permitindo pela primeira vez a obtenção de um espectro de RMN de 10 e a análise das ressonâncias situadas no envelope paramagnético do mesmo, para os estados oxidado e reduzido do centro heterometálico. Tendo em conta a dificuldade de obtenção da DgFdII em termos de tempo e de quantidade, foi feita a clonagem e sobre-expressão desta proteína em E.coZi, utilizando o vector de expressão pT7-7. Foi posteriormente realizada uma breve caracterização espectroscópica da proteína sobre expressa; DgFdIIrec• Finalmente, foi isolada de Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774, uma nova ferredoxina do tipo 2 x [4Fe-4S]. Esta proteína foi posteriormente caracterizada bioquimicamente e por espectroscopia de RMN de 10 e 20, utilizando a mesma metodologia e informação obtida para a DgFdIIint.

Junta Nacional de Investigação Científica e Tecnológica (JNICT),Fundação Luso-Americana para o Desenvolvimento(FLAD)e Fundação Calouste Gulbenkian