Study the function of the newly discovered TrkB receptor fragment (TrkB-ICD) formed by calpain cleavage

Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2016

A Doença de Alzheimer (DA) é a forma mais prevalente de demência em todo o Mundo (totalizando entre 60 a 70% de todos os casos diagnosticados de demência). Esta é uma doença neurodegenerativa crónica caracterizada por diferentes estadios de progressão, culminando em atrofia cerebral globalizada e em perda neuronal substancial em áreas cerebrais particulares, com especial foco no hipocampo e no córtex entorrinal. Com base nos inúmeros estudos desenvolvidos nas últimas décadas, actualmente, a comunidade científica considera a DA uma doença resultante da acumulação extraneuronal do péptido β-amilóide (Aβ) e acumulação intraneuronal da forma hiperfosforilada da proteína tau. Para além da acumulação cerebral das proteínas anteriormente referidas, nesta doença, também se sabe estar presente uma desregulação da sinalização mediada pelo Factor Neurotrófico derivado do Cérebro (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF). O BDNF, através da activação da isoforma completa do seu recetor (TrkB-FL), é responsável pela activação de vias moleculares essenciais à sobrevivência e diferenciação neuronais, bem como à transmissão e plasticidade sinápticas. Tanto em amostras de tecido cerebral post-mortem de pacientes com DA como em cérebros de modelos animais de DA foi possível detetar níveis diminuídos de BDNF e do recetor TrkB-FL bem como aumento significativo das isoformas truncadas do recetor TrkB (TrkB-Tc), consideradas inibidoras da sinalização do TrkBFL. Este comprometimento da função do BDNF implica alterações profundas na homeostasia celular, uma vez que se assiste a uma perda significativa das funções celulares mediadas por esta neurotrofina. Desta maneira, actualmente considera-se que a perda de sinalização do BDNF poderá directamente contribuir para a morte neuronal associada à neurodegeneração. Recentemente, foi descrito um novo mecanismo que está também subjacente à perda de sinalização do BDNF na DA: clivagem do recetor TrkB-FL. Na verdade, um dos efeitos neurotóxicos associados à acumulação do péptido Aβ está associado a um aumento significativo dos níveis de cálcio intracelulares, através de inúmeros mecanismos, incluindo a interacção com receptores transmembranares (como os receptores NDMA), a disrupção membranar através da formação de poros e ainda a produção de espécies reactivas de oxigénios. Por sua vez, existe um grupo particular de enzimas dependentes dos níveis de cálcio que, neste contexto, são sobre-activados e conduzem a clivagem dos recetores TrkB-FL. Assim, como consequências desta clivagem, observa-se uma diminuição dos níveis do recetore TrkB-FL e a respectiva formação de dois fragmentos: 1) um novo receptor truncado (TrkB-T’) e 2) um fragmento intracelular (TrkB-ICD) que e libertado para o citosol. Contudo, tendo em conta que este mecanismo associado a perda de sinalização do BDNF foi recentemente descrito, não existia, até ao momento, qualquer tipo de caracterização destes fragmentos e do seu possível papel na patofisiologia da DA. Desta maneira, este trabalho foi delineado por forma a caracterizar o fragmento intracelular TrkB-ICD e estudar o seu possível papel na DA. Para responder aos objectivos propostos, foram usados dois tipos celulares distintos: linha celular de neuroglioma humano (células H4) e culturas primárias de neurónios corticais de rato. Inicialmente, procedeu-se a optimização de diversos parâmetros do protocolo de transfecção, de modo a garantir a expressão óptima da proteína de interesse (TrkB-ICD) em ambos os tipos celulares usados. De seguida, usando Ciclohexamida (CHX, 5 μM), composto inibidor da síntese proteica de células eucarióticas, foi avaliada a estabilidade do fragmento TrkB-ICD. Os resultados obtidos indicam que este fragmento e uma proteína estável e com um tempo de semi-vida próximo das oito horas, período suficientemente longo para ser possível colocar a hipótese de que o fragmento possa interferir com a homeostase da célula. Outro grupo de resultados obtidos através da técnica de imunofluorescência e de um protocolo de fraccionamento celular, indica claramente que o fragmento em estudo é gradualmente translocado para o núcleo, um processo que e dependente da actividade de cinase do próprio fragmento. É importante notar que a dinâmica de translocação é diferente nos tipos celulares usados. Nos neurónios primários, a translocação nuclear e observada após 24 horas de expressão do fragmento e na linha celular H4, após cerca de 48 horas. Este trabalho revelou ainda que, quando comparado com células não transfectadas, o fragmento TrkB-ICD induz uma fosforilação robusta em inúmeras proteínas, indicando que esta proteína apresenta actividade de cinase. Para além disso, ensaios com CHX demonstram que esta actividade de cinase se mantém constante ao longo do tempo, enquanto que, ensaios com K252a (5 μM), fármaco inibidor da actividade de cinase dos recetores Trk, indicam que as proteínas fosforiladas pelo TrkB-ICD são rapidamente desfosforiladas, possivelmente através de fosfatases. Por fim, através do uso de um conjunto de seis fármacos inibidores das principais vias de sinalização descritas em células eucariotas, observámos que a fosforilação induzida pelo fragmento em estudo poderá ser positivamente modulada pela via que inclui a Proteína Cinase A, uma vez que se assiste a uma diminuição drástica do padrão de fosforilação induzido pelo fragmento TrkB-ICD quando as células transfectadas são incubadas com o inibidor desta via (H-89, 25 μM). Assim sendo, as evidências acima enumeradas suportam a hipótese de que o fragmento TrkB-ICD poderá ter um papel importante na patofisiologia da DA, podendo actuar como regulador de vias de sinalização ou regulador da transcrição genética, uma vez que se acumula no domínio nuclear. Desta maneira, os resultados deste trabalho poderão vir a tornar-se a base de trabalho futuro que permita identificar novos alvos farmacológicos para o tratamento da DA.

Alzheimer’s Disease (AD) is the most common form of dementia worldwide (60-70% of all cases) and the accumulation of amyloid-beta (Aβ) peptide in the brain is considered as one of the main hallmarks of this disease. Indeed, AD is a chronic neurodegenerative disease with different stages of progression, leading to general atrophy and neuronal loss of particular brain regions, such as hippocampus or entorhinal cortex, which promotes cognitive and functional impairment. Actually, accumulation of Aβ peptide contributes to neuronal death, since its accumulation on Aβ plaques induces neurotoxicity at different levels and through different mechanisms. Hence, AD is considered a protein misfolding disease and Aβ peptide is considered the main player of its etiology. Simultaneously, Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) signalling is seriously impaired in AD, which consequently compromises its physiological functions: neuronal survival, differentiation and plasticity. Actually, decreased levels of BDNF and its receptor (TrkB Full-Length, TrkB-FL), as well as increased levels of truncated TrkB receptors (TrkB-Tc), a dominant negative inhibitor of TrkB-FL, were already described in AD and led to the postulation that this loss of BDNF signalling could directly contribute to neurodegeneration. Recently, it was discovered a new mechanism that also contributes to the impairment of BDNF signalling in AD: TrkB-FL cleavage. Indeed, accumulation of Aβ peptide promotes a sustained increase of intracellular Ca2+ levels, by distinct mechanisms, which in turn leads to calpains overactivation and subsequent TrkB-FL cleavage. As consequences, TrkB-FL levels decreases and two fragments are generated: a membrane-bound truncated receptor (TrkB-T’) and an intracellular fragment (TrkB-ICD) that is released to cytosol. However, there was no further characterization about these new fragments. Thus, this work was designed to characterize TrkB-ICD fragment and to study its putative role in AD pathophysiology. In this way, to reach the goal of this work, we used a human neuroglioma cell line (H4 cells) and primary rat cortical neurons. Initially, we optimized the transfection protocol in order to ensure the optimal TrkB-ICD expression on both cells type used. Then, we evaluated the stability of TrkB-ICD using cyclohexamide treatment (5 μM). The obtained data shows that this fragment is a stable protein with a half-life time of 8 hours, approximately, suggesting that TrkB-ICD is not immediately degraded. Immunofluorescence assays and subcellular fractionation protocols performed also indicate that TrkB-ICD accumulates within the cell nucleus over time, a translocation process dependent on its own phosphorylation. Furthermore, we clearly show that TrkB-ICD induces a significant phosphorylation of several proteins at nucleus, soma and neuronal processes, showing that this fragment has constitutive tyrosine kinase activity. Finally, by using several inhibitors of the major signalling pathways in eukaryotic cells, we can conclude that protein phosphorylation induced by TrkB-ICD is probably modulated in a positive way by PKA pathway. The results obtained support the hypothesis that the TrkB -ICD fragment may play a role in AD pathophysiology either by acting as regulator of signalling pathways or, since it accumulates in the nucleus, as regulator of gene transcription. Thus, data obtained in this work could underlie future work that might allow the identification of new pharmacological targets for the treatment of AD and further research on this fragment could also unveil if TrkB-ICD fragment can be considered a biomarker for AD.