Detecção do vírus do papiloma humano por PCR em tempo real : relevância para medicina legal

Tese de mestrado, Medicina Legal e Ciências Forenses, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Introdução: O presente estudo visa demonstrar a importância das técnicas in house com relevância para o PCR em tempo real, na detecção e genotipagem do VPH e o seu contributo na Medicina Legal (ML). As infecções mais comuns em vítimas de violência sexual são a clamídea, gonorreia, sífilis e trichomonas, existindo igualmente o risco de contrair infecções virais, nas quais se destaca a infecção pelo VPH. Esta apresenta uma elevada infecciosidade com impacto ao nível da prevalência na população em geral. As infecções sexualmente transmissíveis (IST) em contexto ML são indicadores biológicos nos casos de abuso evidente ou declarados e a manifestação da infecção em crianças, idades não sexualmente activas, pode ser sugestiva quanto ao modo de transmissão ocorrido. A detecção do ADN viral e identificação do genótipo específico poderá contribuir no esclarecimento de situações com potenciais implicações sócio-médico-legais. Objectivo: Implementação, optimização e validação de um ensaio de PCR em Tempo Real para a detecção qualitativa do VPH (rastreio) em amostras biológicas (esfregaços e biópsias) do colo. Demonstrar o desempenho do ensaio face aos critérios estabelecidos, tendo em conta normas científicas e o estado arte. Possibilitar a identificação do genótipo da amostra positiva para o ADN do VPH. Metodologia: O desenho do ensaio conteve diferentes etapas de preparação: Extracção do ADN, adaptação das condições de PCR e interpretação analítica do resultado produzido (positivo ou negativo). Implementação do programa de monitorização e controlo da qualidade pela caracterização do método de ensaio nas suas variáveis de sensibilidade e especificidade analítica. Determinação dos valores preditivos positivo e negativo numa população específica analisada. Resultados: O ensaio desenvolvido permite a detecção de cerca de 30 genótipos diferentes do vírus do papiloma humano com limite de detecção 5 UI/ml para os genótipos mais prevalentes VPH16 e VPH18. O desempenho do ensaio quanto à sua sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo, foi calculada para situações de lesões maiores ou iguais a CIN 2+ (Classificação Bethsheda) onde a melhor estimativa, foi de 85.6%, 58.1%, 33.7% e 94.2%, respectivamente. Conclusões: A metodologia de ensaio laboratorial desenvolvida proporciona robustez, fiabilidade e exactidão no resultado que produz. Disponibiliza inovação (tecnologia e económica) face as técnicas comerciais existentes na detecção deste vírus e constitui uma mais-valia contexto ML.

Introduction: This study aims to demonstrate the importance of the molecular biology techniques, especially for in house real-time PCR, used for HPV detecting and genotyping and their contribution in Forensic Medicine (FM). The most common infections in victims of sexual violence are chlamydia, gonorrhea, syphilis and trichomonas, and there is also the risk of acquire viral infections, such HPV infection, that shown a high infectivity with impact on the prevalence in the general population. Regarding to FM context the sexually transmitted infections (STIs), are biological indicators in cases of obvious or declared abuse and the manifestation in children, ages normally with no sexual activity, may be suggestive about the way the transmission occurred. The detection of HPV DNA and identification of the specific genotype may help to clarify some situations that may have social, medical and legal implications. Objective: Optimization, implementation and validation of a PCR test in Real-Time for qualitative detection of HPV, in biological samples of cervix (smears and biopsies) associated with the presence of HPV. Demonstrate the performance of the assay compared with established scientific standards criteria, and a state of art. Enable the genotype identification of positive sample for HPV DNA. Methodology: The test layout had different stages of preparation: Extraction of biological sample, adjustment of the amplification reaction conditions and analytical interpretation of the result produced for the presence of HPV DNA (positive or negative). Implementation of a monitoring program and quality control. Characterization of the test method regarding its variables analytical on sensitivity and specificity. Determination of positive and negative predictive values in a specific population under analysis. Results: The test results proved to be reliable for the detection of about 30 different genotypes of the human papillomavirus with a detection limit of 5 IU / ml for most prevalent genotypes HPV16 and VPH18. The performance of the test regarding its sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value has been calculated for lesions situations greater than or equal to CIN 2+ (Bethsheda Classification) where the best estimate was 85.6%, 58.1%, 33.7% and 94.2%, respectively. Conclusions: The methodology developed in this laboratory test provides strength, reliability and accuracy on the result produced. It provides innovation (technology and economy) in relation to existing commercial techniques for detection of this virus and can be applied in required situations on FM context.