How does developmental plasticity differ between diverse types of nutrition regimes?

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016

A composição do substrato é muitas vezes o fator mais limitante quando se fala em stress nutricional porque os indivíduos precisam de regular muito bem a ingestão dos nutrientes presentes na comida para a manutenção da sua homeostasia. Os macronutrientes são essenciais para formação e manutenção de tecidos e para processos metabólicos e os animais têm de compensar a sua falta através de alocação de recursos ou decisões baseadas no gasto desses recursos em atividades indispensáveis para a sobrevivência. Os animais regulam muito bem a ingestão de determinados alimentos uma vez que a qualidade nutricional é essencial ao seu desenvolvimento. Assim, fazem escolhas específicas refletindo as necessidades, a fase do ciclo de vida ou o seu ambiente. Diferentes estratégias de comportamento foram desenvolvidas consoante as necessidades de cada espécie e a nutrição e escolha perante determinadas opções alimentares podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento e evolução das populações, com potencial microevolutivo. Desde que os animais dispersaram e conseguiram migrar para quase todos os habitats possíveis que as espécies estão adaptadas para mudar o seu índice nutritivo, demonstrando plasticidade fenotípica para se adaptarem. Diferentes espécies têm diferentes necessidades nutricionais o que pode levar a alterações de comportamento na ingestão e alocação dos mesmos. Assim os animais, dependendo das suas necessidades, acabam por alterar a perceção do seu ambiente e consequentemente as estratégias a utilizar, tanto ao nível fisiológico como metabólico, para alcançar exigências nutritivas quando os nutrientes são limitados. Esta procura específica por determinado(s) nutriente(s) pode depender de fatores genéticos, ambientais ou da fase específica do ciclo de vida dos indivíduos, já que estes alteram a qualidade e a quantidade de nutrientes, dependendo da altura do desenvolvimento em que se encontram. O consumo controlado de comida tem no entanto alguns benefícios, variando num grande leque de animais taxonomicamente diversos, desde leveduras aos primatas. Tradicionalmente, os efeitos positivos de alguma restrição alimentar foram atribuídos a facto do animal ingerir menos calorias, fazendo uma restrição calórica, uma convenção que ainda levanta alguns problemas. Devido ao carácter nutricional instável de cada substrato, devido entre outras coisas à ação de microrganismos, o balanço dos nutrientes está também em constante mudança. As preferências nutritivas que revelam são geralmente expressas pelo consumo dos dois macronutrientes principais, proteínas e hidratos de carbono, tentando sempre encontrar um equilíbrio, ou rácio, entre ambos que melhore o mais possível a performance. Quando confrontados com situações de poucos recursos e nas quais têm de atingir o seu alvo nutricional otimizado os animais ponderam quais as escolhas possíveis nesse espaço de modo a atingir a melhore quantidade de substrato para o seu desenvolvimento, não só do ponto de vista de ingestão calórica mas também do consumo específico de macronutrientes importantes para o desenvolvimento e sobrevivência. Deste modo têm dois cenários possíveis: (1) quando um dos nutrientes se revela mais importante, a quantidade de comida ingerida é regulada de modo a atingir os níveis ótimos desse nutriente, ingerindo o outro em excesso ou (2) a ingestão em níveis intermédios de ambos os nutrientes. Por estas razões é importante haver estudos que separem bem o efeito entre quais as consequências de ingestão reduzida de calorias ou, mais especificamente, da ingestão de dietas em que foram reduzidos apenas um dos macronutrientes essenciais, deixando o conteúdo calórico intacto. O alvo nutricional varia também ao longo da vida do animal sendo muito específico consoante a sua fase do ciclo de vida. Por exemplo quando a mosca da fruta, Ceratitis capitata, está perto da metamorfose o seu alvo nutricional deixa de ser maioritariamente proteico e passa a conter alto teor de hidratos de carbono que tem a energia necessária para a fase imediatamente antes da metamorfose. Após o acasalamento as fêmeas de Drosophila melanogaster aumentam a sua produção de ovos precisando de uma dieta mais rica em proteínas do que as fêmeas virgens. Muitos exemplos na literatura deixam claro que há uma enorme importância e relação entre as calorias ingeridas, a qualidade nutricional medida pelo rácio dos dois macronutrientes principais e a fase de desenvolvimento em que os animais se encontram. Com este trabalho tentámos compreender quais as consequências para o adulto, quando são impostas restrições nutritivas apenas no desenvolvimento juvenil. Com esta finalidade usámos o modelo animal por excelência em estudos nutricionais e de adaptação fenotípica e comportamental, a mosca do vinagre, Drosophila melanogaster. Com este projeto pretende-se observar quais as modificações dos indivíduos adultos quando alterada apenas a alimentação juvenil e como conseguem alocar os recursos necessários quando têm restrições num dos macronutrientes fundamentais, tentando construir assim uma “base de dados fenotípica” de larvas e adultos em diferentes dietas. Com a importância dos ambientes nutricionais no metabolismo juvenil, que pode traduzir-se em síndromes metabólicas, com consequentes implicações no desenvolvimento, é de grande interesse entender as correlações que influenciam as alterações morfológicas ou comportamentais, condicionando o normal crescimento do organismo com pressões nutritivas diferentes. As características avaliadas, ou life history traits, são conhecidas por serem influenciadas por diferentes ambientes nutricionais. Nas larvas analisámos o tempo de desenvolvimento e a sobrevivência de ovo a pupa uma vez que ambos são afetado pela nutrição. Ainda na fase larval analisámos o cumprimento dos ganchos que fazem parte da estrutura da boca, e variam de tamanho entre os três estágios larvares. Estas estruturas devido à sua plasticidade foram escolhidas porque respondem às diferenças nutricionais alterando-se para permitirem a ingestão de substratos mais duros ou mais diluídos. Como a Drosophila melanogaster é um inseto holometabólico, sofre uma metamorfose complexa antes da fase adulta onde todos os tecidos e órgãos são restruturados e dão origem aos tecidos e órgãos do adulto. Depois da metamorfose os indivíduos param o seu crescimento, ou seja o tamanho do adulto é definido na fase da larva. Assim o tamanho do corpo do adulto foi analisado, através da dissecação de quatro estruturas, asas, fémur, tórax e o palpo maxilar, para perceber qual a influência da alimentação juvenil nesta restruturação dos tecidos. Nos adultos, nestes casos apenas em fêmeas, foram ainda analisadas a longevidade e a fecundidade, já que estas duas características importantes são normalmente inversamente proporcionais, visto que menor fecundidade leva a maior longevidade e vice-versa, bem como altamente dependentes da qualidade nutricional. Para conseguirmos desvendar a influência dos macronutrientes e das calorias ingerida fornecemos aos indivíduos oito dietas diferentes, conseguidas a partir da comida controlo usada naturalmente em laboratório, com um rácio de proteína por hidratos de carbono (P:C) de 1:10 e com 1.44 quilocalorias por mililitro (kcal/ml). Das diferentes dietas, quatro representaram restrições calóricas, 0.72, 0.36, 0.18 e 0.09 kcal/ml, e as restantes quatro foram dietas isocalóricas, na qual apenas se alterou o rácio de P:C, 1:25, 1:50, 1:100 e 1:200. Os nossos resultados demonstram, em relação às características analisadas para as larvas a desenvolverem-se nas oitos diferentes dietas, que o tempo de desenvolvimento de ovo a pupa foi muito aumentado, quando comparadas as dietas entre tratamentos de restrição calórica e restrição de proteína. Em todas as dietas com diferentes rácios de P:C o desenvolvimento foi tendencialmente mais demorado, com o exemplo mais significativo na dieta de 1:200, com um tempo médio de aproximadamente 400 horas. Nas restrições calóricas o aumento mais extremo observou-se na diluição de 0.09kcal/ml e foi de aproximadamente 200 horas. Nas análises de sobrevivência de ovo até pupa, os resultados foram mais significativos no rácio de 1:200 e verificámos que 20% dos indivíduos sobrevive, apresentado uma taxa de sobrevivência maior do que inicialmente previsto. O resultado mais parecido com este, nas restantes dietas analisadas, foi na diluição de 0.09kcal/ml cuja taxa de sobrevivência foi de 45%, subindo até chegar à diluição controlo. Ainda nas características larvares, o comprimento dos ganchos das bocas das larvas medido apenas nas larvas nos estágios L2 e L3, não foi muito diferente do controlo com diferenças muito pequena de tamanho entre todas as dietas. No caso dos adultos, para as características morfológicas, encontrámos diferenças significativas nos quatro órgãos analisados. Todas as dietas com menos proteínas e calorias apresentam um menor tamanho nas dietas mais extremas, de ambos os tratamentos, com valores muito parecidos entre si e significativamente mais pequenos que as dietas controlo. Nos resultados de longevidade e fecundidade, as observações foram de encontro ao esperado. No rácio 1:200 as fêmeas puserem poucos ovos nos 7 primeiros dias e viveram significativamente menos que as fêmeas controlo, começando a morrer no dia 9 com a última mosca viva registada no dia 14. Já no rácio de 1:50 e nas duas dietas diluídas, 0.36 e 0.09 kcal/ml, as fêmeas embora tenham posto menos ovos que na comida controlo, viveram mais tempo do que as moscas no rácio standard de 1:10. Estes resultados demonstram bem que a alimentação juvenil tem efetivamente um impacto no desenvolvimento e performance reprodutiva do adulto. Também é possível concluir que os macronutrientes, mais especificamente as proteínas, influenciam toda a vida do animal, mesmo sendo um fator limitante no desenvolvimento juvenil. No entanto uma das grandes conclusões a retirar deste projeto é também o facto de, para a D. melanogaster, o desenvolvimento juvenil em dietas com mesma quantidade de proteína mas com diferentes quantidades de calorias, faz variar as tendências das características fenotípicas e morfológicas analisadas o que é bem demonstrativo das diferenças entre fazer uma restrição calórica ou uma restrição de um macronutriente específico, no caso, a proteína. Isto significa que não é apenas este nutriente que é importante na dieta mas o rácio de proteína:carbohidratos, ou a proteína no contexto da quantidade de hidratos de carbono. Isto é especialmente verdade nas análises de longevidade dos adultos em que os fenótipos dos dois tratamentos vão em direções opostas.

Both developmental nutrition and adult nutrition affect life history traits, however little is known about the importance of specific nutrients relative to calories and the effects on adult traits such as lifespan or fecundity. The architecture of dietary requirements can respond to selection with a microevolutionary potential, but it is not clear whether these effects are due to caloric composition or due to the concentration and combination of macronutrients. Using Drosophila melanogaster, I compared the effects of different types of larval diets, differing in calories, protein, and carbohydrate content, and how they modify the response of both larval and adult life history traits. Using our standard lab medium as control, with a protein: carbohydrate (P:C) ratio of 1:10 and a caloric content of 1.44 kcal/ml, I diluted the protein content of the larval diet in two ways: either caloric dilutions maintaining a constant P:C ratio (1:10) but reducing caloric content to 0.72, 0.36, 0.18 and 0.09 kcal/ml, or macronutrient restriction where I substituted the calories from protein with carbohydrates from sucrose to generate four isocaloric diets (1.44 kcal/ml) that varied in their P:C ratios, 1:25, 1:50, 1:100 and 1:200. I reared larvae from an outbred population on each of these diets and assessed the effects on larval and adult traits. Larval traits included survival and developmental time from egg to pupae, development time in the second and third instar, and larval mouth hook length. For adults, I measured the size of adult organs, lifespan, and early fecundity. Overall, I found that macronutrient restriction generated more severe phenotypes, increasing development time and decreasing survival and mouth hook size more than caloric restriction. The two diet types produced animals of different shapes, with body parts differing in their least squared means and the slopes of their reaction norms in a complex manner with diet type. The larval diet types differed dramatically in their effects on lifespan; macronutrient restriction significantly shortened lifespan while caloric restriction dramatically lengthened lifespan. Finally, macronutrient restriction of the larval diet reduced early fecundity more than caloric restriction at the same protein concentration. Our results demonstrate that juvenile nutrition impacts both larval and adult life history traits, and is capable of modulating adulthood. Further, our data shows that altering the composition of the juvenile diets by caloric versus macronutrient restriction induces different responses in the life history traits analyzed, demonstrating both the importance of diet in juvenile development and its role in adult performance.