Avaliação do potencial clínico de novos ligandos para o receptor estrogénico em diagnóstico e terapia de tumores da mama

Tese de doutoramento, Química (Química Inorgânica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015

O trabalho apresentado nesta tese teve como objectivo o desenvolvimento de novas moléculas da família do estradiol com especificidade biológica para o receptor de estrogénio (RE) e com interesse no diagnóstico, prognóstico e/ou terapia sistémica de carcinomas invasivos da mama. Com esse objectivo, procedeu-se à síntese e caracterização de derivados de estradiol (L1-L7), funcionalizados na posição C16, com diferentes unidades quelantes bifuncionais (DOTA, DTPA; DOTAGA e NOTAGA) ou com uma unidade intercaladora de ADN, o alaranjado de acridina AO (3.8) ou com uma sonda fluorescente, BODIPY (4.3, 4.4). Estes conjugados foram sintetizados na perspectiva de veicularem selectivamente radionuclídeos (111In e 67Ga), AO ou BODIPY para o interior de células de cancro da mama. Os compostos L1-L7 foram utilizados na preparação de complexos de In/111In e Ga/67Ga. Os estudos de afinidade para o receptor revelaram que os compostos L5-L7, InL5, InL6 e 3.8 possuiam afinidade e eram selectivos para o subtipo α do RE. Os complexos 111InL1-111InL6, 67GaL2 e 67GaL7 foram obtidos com elevado rendimento e pureza radioquímica, utilizando baixas concentrações de ligando. A maioria dos complexos demonstraram ser estáveis in vitro e in vivo. Estudos de captação em linhas celulares de adenocarcinoma da mama MCF-7 e MDA-MB-231 revelaram taxas de captação relativamente baixas, consistentes com o carácter hidrofílico da maioria dos compostos, sugerindo no entanto captação mediada pelo RE. Ensaios de biodistribuição revelaram rápida depuração sanguínea e rápida captação hepática. O composto 67GaL7 apresentou fixação uterina e ovárica mais elevada indicando os ensaios de saturação dos receptores para um mecanismo mediado pelo RE. Por microscopia confocal de fluorescência, verificou-se que o composto estradiol/AO internalizava em células MCF-7, localizando-se no núcleo. Os compostos fluorescentes estradiol/BODIPY demonstraram elevados rendimentos quânticos podendo ser utilizados em microscopia de fluorescência. Verificou-se também que atravessavam a membrana plasmática, não se observando internalização nuclear.

The work described in this thesis has been focused on the development of a new family of estradiol molecules with specificity for estrogen receptors (ER) aiming its potential application in invasive breast cancer diagnosis, prognosis and/or systemic therapy. To this end, a set of estradiol derivatives (L1-L7), functionalized at C16 with different bifunctional chelating agents (DOTA, DTPA, DOTAGA and NOTAGA) with acridine orange (AO), a DNA intercalating unit (3.8), or with the fluorescent probe BODIPY (4.3, 4.4) were synthesized and characterized. These conjugates were synthesized aiming the selective delivery of radionuclides (67Ga and 111In), AO or BODIPY into breast cancer cells. The L1-L7 compounds were the precursors used to prepare In/111In and Ga/67Ga complexes. The receptor binding affinity studies indicated that the L5-L7, InL5, InL6 and 3.8 compounds have ER affinity and are selective to ERα subtype. The complexes 111InL1-111InL6, 67GaL2 and 67GaL7 were obtained in high yield and radiochemical purity at low ligand concentrations. Most of the complexes are highly stable both in vitro and in vivo. Cellular uptake studies in breast adenocarcinoma MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines have shown moderate to relatively low uptake rates, consistent with the hydrophilic character of most compounds. Nevertheless results from receptor saturation assays suggested that the uptake may occur by an ER-mediated process. Biodistribution studies in animal models indicated rapid blood clearance and rapid excretion though the hepatobiliar pathway. The highest uterine and ovarian uptake was found for 67GaL7 and receptor blockade studies indicated an ER-mediated uptake mechanism. The hybrid compound estradiol/AO internalizes into MCF-7 cells and localizes in the cell nucleus, as demonstrated by confocal fluorescence microscopy analysis. The fluorescent compounds estradiol/BODIPY have demonstrated high quantum yields and can be used in fluorescence microscopy. These compounds are able to cross the cell membranes but no nuclear internalization was observed.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), SFRH/BD/43432/2008, projeto PTDC/QUI-QUI/111891/2009, projeto EXCL/QEQ-MED/0233/2012