Genetic characterization of the South Portugal population with GlobalFilerTM Express kit - internal validation and forensic applications

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

In forensic analysis, DNA is used in three major areas: to perform individual identification analyses, biological kinship testing and criminalistics. To perform these tests, STRs from DNA non-coding regions are currently used, amplified emplying commercial kits. In the last years, with the evolution of technology and the extension of the European Standard Set to 12 loci, new kits have been released to be used in this area. The GlobalFiler™ Express is one of them. It’s a 6 dyes kit which permits direct amplification of 24 loci (21 autosomal STR loci, 1 InDel locus, 1 Y-STR locus and Amelogenin) in a single PCR reaction. With the purpose of investigating the potential and limitations of using this set of molecular markers in South Portuguese population an internal validation study was performed, as well as a population study with 404 unrelated individuals involved in paternity casework, residing in the South Portugal area. The 404 bloodstains were directly amplified using GlobalFiler™ Express and the amplified products were separated and detected by capillary electrophoresis. The internal validation study confirmed that the markers have all the requirements to be used hereafter in forensic casework. Allele frequencies of each marker were estimated using Arlequin V3.5 software and no deviation from Hardy-Weinberg equilibrium was found. Forensic parameters were analyzed using PowerStats V1.2. The SE33 was the most polymorphic locus and the TPOX was the least one. The combined power of discrimination was 0.999999999999999999999999981765, the combined probability of match was 1.8356x10-26 and the combined power of exclusion was 0.99999999966339800. In conclusion, this commercial kit fulfills all the requirements for forensic identification use in South Portuguese population and its use can be an asset since it greatly reduces the time spent in analysis and greatly increases the power of discrimination and power of exclusion.

Na genética forense a determinação do perfil genético de um individuo é utilizada principalmente em três grandes vertentes: identificação individual, investigação de parentesco biológico e criminalística biológica. Para a determinação desse perfil genético os marcadores moleculares utilizados actualmente são do tipo microssatélites, os denominados STRs (do Inglês Short Tandem Repeats). Estes marcadores encontram-se dispersos por todo o genoma humano, contudo, os que são utilizados na área forense estão localizados apenas na zona não codificante do genoma. A escolha deste tipo de marcadores advém de inúmeros factores, nomeadamente pelo facto de possuírem um elevado poder de discriminação e de serem facilmente amplificados através da reacção de PCR. Para além do uso de STRs autossómicos, em casos mais complexos ou em que o ADN se encontra degradado, também se recorre à determinação de perfil de ADN mitocondrial ou de marcadores do cromossoma Y ou X, para dar mais força à evidência biológica. Existem também estudos de perfis genéticos com marcadores do tipo InDel (polimorfismos de inserção/deleção) e de SNPs (do Inglês Single Nucleotide Polymorphisms). Contudo, estes últimos tipos de marcadores, individualmente, apresentam um menor poder de discriminação relativamente aos STRs e a nível de processos jurídico-criminais, em Portugal, não são ainda usados. Tal como nos EUA existe o sistema CODIS, na Europa também é utilizado um painel de marcadores mínimo para identificação, o European Standard Set (ESS). Até 2009, esse painel era composto por 7 marcadores, tendo sido realizada nesse ano uma extensão do ESS, passando a partir daí a ser constituído por 12 marcadores. Esta extensão adveio da recomendação de incluir alguns marcadores do tipo mini-STR, pois estes possibilitam um aumento na probabilidade de obtenção de perfis em amostras degradadas, estabelecendo um maior número de marcadores comuns o qual possibilita a partilha de dados de perfis genéticos entre os diferentes países. Após essa extensão, e com o enorme desenvolvimento de técnicas e tecnologias ocorrido nos últimos anos, actualmente têm surgido novos kits comerciais que permitem amplificar numa única reacção de PCR um elevado número de marcadores moleculares. O GlobalFilerTM Express é um desses kits de nova geração, lançado em Setembro de 2012. Para além do facto de permitir que sejam amplificados 24 loci (D3S1358, vWA, D16S539, CSF1PO, TPOX, D8S1179, D21S11, D18S51, D2S441, D19S433, TH01, FGA, D22S1045, D5S818, D13S317, D7S820, SE33, D10S1248, D1S1656, D12S391, D2S1338, DYS391 e 1 Y InDel), numa única reacção de PCR, este kit permite a amplificação directa do ADN a partir da mancha de sangue ou da zaragatoa. Assim, e dado que a amplificação é extremamente rápida, ocorrendo em menos de 40 minutos, é possível a obtenção dum perfil genético, através de manchas de sangue, em pouco mais de hora e meia. Sendo também este o único kit no mercado que utiliza 6 fluoróforos na marcação dos diferentes loci, possibilita que exista espaço suficiente entre os marcadores adjacentes, minimizando os chamados OL (do Inglês Off Ladder) e, principalmente, permite que 10 destes marcadores sejam mini-STRs, com menos de 220 pares de bases. Para avaliar o potencial e as possíveis limitações da utilização dos marcadores moleculares incluídos neste kit na população do Sul de Portugal, realizou-se a validação interna do mesmo e fez-se um estudo populacional utilizando 404 amostras de referência do serviço de genética e biologia forenses (SGBF-S), de indivíduos residentes no Sul de Portugal, envolvidos em casos de paternidade. Através do processo de validação interno realizado, o kit GlobalFilerTM Express, demostrou preencher todos os requisitos necessários para amplificação e análise forense de ADN humano e, demonstrando características relevantes para que, futuramente, o mesmo possa vir a ser utilizado na rotina do SGBF-S do INMLCF. A sua especificidade, repetibilidade e reprodutibilidade foram comprovadas, assim como a sua concordância e capacidade para distinguir amostras contaminadas. Foi também realizado o estudo da sua sensibilidade, que não se revelou muito elevada, mas dado que se trata de um kit para amplificar ADN a partir de amostras de referência, esse facto não deverá ser um entrave à sua utilização. A nível populacional, usando o programa Arlequin V3.5, foram estimadas as frequências alélicas de cada marcador autossómico e verificou-se que todos os loci se encontravam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Seguidamente foi efectuado um estudo comparativo entre a amostra do Sul de Portugal e de outras populações. Os resultados dessa comparação permitiram aferir que as populações europeias em estudo (Portugal, Espanha, Itália, Alemanha, Áustria e Suécia) são muito similares entre si, assim como também a população caucasiana dos Estados Unidos América é muito próxima de todas elas. A única população que revelou diferenças significativas com a nossa amostragem foi a população da Coreia do Sul. Para o cálculo dos parâmetros estatísticos de interesse forense foi utilizando o PowerStats V1.2. Individualmente o locus que apresentou maior polimorfismo foi o SE33 com 0,9457 de PIC, sendo também o locus com menor probabilidade de coincidência (0,0077), maior poder de discriminação (0,9923) e maior poder de exclusão (0,8788). Por outro lado o locus menos polimórfico foi o TPOX com um valor de PIC igual a 0,5806, sendo também este o que apresentou menor poder de exclusão (0,3300) e de discriminação (0,8182) e maior probabilidade de coincidência (0,1818). Com o uso combinado de todos os marcadores autossómicos, o poder de discriminação determinado foi de 0,999999999999999999999999981765, a probabilidade de coincidência foi de 1,8356x10-26 e o poder de exclusão foi de 0,99999999966339800. Pode assim concluir-se que este novo kit comercial preenche todos os requisitos necessários para uso em identificação genética na população do Sul de Portugal, sendo o seu uso uma mais-valia nesta área, uma vez que permite não só tornar todo o processo muito mais rápido como também aumentar, em muito, o poder de discriminação e de exclusão.