Role of β-adrenergic signaling in ovarian cancer cells biology

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Human ovarian cancer is the seventh most common tumour in women worldwide and the leading cause of death from gynaecological cancers. Nowadays, there is strong evidence that stress affect cancer progression and patient survival. However, the underlying mechanisms of this association are poorly understood. The catecholamines (CA), adrenaline (AD) and noradrenaline (NA), are released in response to stress, exerting their effects through interaction with adrenergic receptors (AR) termed α and β. β-AR expression has been identified on several ovarian cancer cells. The activation of these receptors triggers several pathways that alter tumour microenvironment, being associated to carcinogenesis and tumour progression. β-blockers have a long history of use for treatment of arrhythmia, hypertension, anxiety, and heart failure treatment, among others. Epidemiological studies show that β-blockers are associated with a decrease of cancer mortality and studies about the efficiency of β-AR as a possible treatment for cancer are acquiring strength. The effects of several β-blockers with distinct intracellular target profiles in human ovarian cancer cells SKOV-3 biology were investigated. Cellular proliferation and migration ability after exposure to the agonists AD, NA and isoprenaline (ISO) and the antagonists propranolol, carvedilol, atenolol and ICI 118,551 per se, or combined with each other, was investigated. AD was able to significantly increase the proliferation of SKOV-3 cells, ISO induced a tendency to increase proliferation, whereas NA had no effect. Our results suggest that β-blockers reduce SKOV-3 cells proliferation, but, similarly to the tested agonists, have no effect on SKOV-3 migration. This study might contribute to elucidate which are the most effective β-blockers in reverting CA induced proliferative effects in ovarian cancer cells and, consequently, to be used as promising strategies in cancer treatment.

O cancro do ovário é o sétimo cancro mais comum nas mulheres em todo o mundo e aquele que apresenta uma maior taxa de mortalidade de entre os cancros ginecológicos. A resposta ao stresse conduz à ativação de dois sistemas neurohumorais, o eixo hipotálamo-hipófise-suprarrenal e o sistema simpatoadrenomedular, que libertam cortisol e catecolaminas (CA), respetivamente, exercendo um papel crucial na função cardiovascular e no metabolismo energético. No entanto, esses sistemas, sob influência dos padrões de vida atual, por exemplo quando repetidamente ativados por longos períodos de tempo, podem deixar de ter uma ação adaptativa e conduzir a doença. De acordo com isto, fortes evidências sugerem que o stresse crónico está associado à progressão do cancro e também à taxa de sobrevivência. No entanto, os mecanismos envolvidos na ligação entre a exposição ao stresse e os efeitos na biologia tumoral são ainda mal conhecidos. As CA, adrenalina (AD) e noradrenalina (NA), como referido acima, são libertadas a partir do sistema simpatoadrenomedular em resposta ao stresse, exercendo os seus efeitos através da interação com recetores adrenérgicos do tipo α e β. Os recetores adrenérgicos, preferencialmente os do tipo β, estão expressos em várias células de cancro do ovário. A ativação destes recetores por sua vez promove a ativação de várias cascatas de sinalização que alteram o microambiente tumoral, estando associadas à progressão dos tumores e a eventos como a carcinogénese. Na verdade, vários estudos mostraram a relação entre os recetores adrenérgicos β e parâmetros de dinâmica celular como a angiogénese, a proliferação, a apoptose, a inflamação, a resposta imunitária, a migração, a invasão e a formação de metástases. Os bloqueadores β são usados clinicamente há décadas no tratamento de sintomas e patologias como arritmias, hipertensão, ansiedade, e insuficiência cardíaca, entre outros. Estudos epidemiológicos relativos a vários tipos de cancro têm mostrado que os bloqueadores β estão associados a uma diminuição da taxa de mortalidade. Como tal, esforços têm sido desenvolvidos no sentido de estudar a eficácia destes fármacos como adjuvantes no tratamento do cancro. Curiosamente, os estudos epidemiológicos também têm revelado que nem todos os bloqueadores β apresentam este benefício sobre a mortalidade e a agressividade dos tumores. Na nossa opinião isso pode dever-se aos diferentes perfis farmacológicos destes fármacos. Neste trabalho foram avaliados os efeitos de vários bloqueadores β, com diferentes perfis farmacológicos para alvos intracelulares, na biologia de células humanas de cancro do ovário denominadas SKOV-3. Para este propósito, avaliou-se o efeito dos agonistas AD, NA e isoprenalina (ISO; agonista adrenérgico sintético com elevada afinidade para os recetores β) e dos antagonistas, propranolol (PRO; não seletivo para os recetores adrenérgicos β ), carvedilol (CAR; não seletivo para os recetores adrenérgicos β e seletivo para os α1), atenolol (ATE; seletivo para os recetores adrenérgicos β1) e ICI 118,551 (ICI; seletivo para os recetores adrenérgicos β2), quando aplicados isoladamente e em combinação agonista/antagonista na proliferação e migração destas células. Numa primeira fase do trabalho, foram estabelecidas curvas de crescimento da cultura celular durante oito dias para caracterizar os parâmetros dinâmicos deste tipo de células. Posteriormente, foram realizadas várias experiências com o intuito de determinar os valores de EC50 e IC50, respetivamente para o efeito proliferativo e anti-proliferativo dos vários agonistas e antagonistas dos recetores adrenérgicos. De todos os agonistas em estudo, apenas a AD aumentou significativamente a proliferação das células SKOV-3, a ISO tendencialmente aumentou a proliferação destas células e a NA não teve qualquer efeito. No sentido de esclarecer quais os subtipos de recetores adrenérgicos que estariam envolvidos no aumento da proliferação induzida pelos agonistas, as células foram previamente tratadas com diferentes antagonistas, e depois igualmente expostas a estes fármacos em simultâneo com os agonistas. À exceção do CAR, todos os antagonistas foram capazes de reverter o efeito proliferativo da AD e da ISO. Apesar da NA não ter tido efeito por si só na proliferação das células SKOV-3, todos os antagonistas, quando aplicados em simultâneo com esta amina foram capazes de reduzir significativamente a proliferação destas células. Estes resultados estão de acordo com o facto de estes antagonistas terem já sido descritos como agonistas inversos, mostrando a complexidade dos seus efeitos na proliferação celular. Este é um dado importante a ter em conta no estudo dos efeitos dos bloqueadores β na proliferação celular e noutros parâmetros biológicos, uma vez que isto pode explicar a maior ou menor eficácia de alguns destes fármacos como adjuvantes no tratamento do cancro. Os nossos resultados sugerem que os bloqueadores β diminuem a proliferação das células SKOV-3, mas, tal como os agonistas testados, não têm qualquer efeito na migração. De facto, as experiências de avaliação da capacidade de migração celular realizadas 6, 24 e 30 horas após os tratamentos com os vários fármacos em estudo (AD, NA, ISO, PRO, ATE, CAR e ICI) não mostraram qualquer efeito neste parâmetro. A concentração de CA é cerca de 10 vezes superior no ovário comparativamente à encontrada em circulação. Alguns autores sugerem que isto se deve a uma elevada inervação simpática dos tecidos ováricos, que concorre para uma elevada concentração de CA nestes tecidos, mas outros referem a possibilidade das células do ovários serem capazes de produzir CA. No sentido de esclarecer se as células SKOV-3 produzem estas aminas, realizou-se um estudo piloto de quantificação de CA por cromatografia líquida de alta pressão com deteção eletroquímica (HPLC-ED). Os resultados mostraram que estas células são capazes de produzir NA, mas não AD. A realização de mais experiências permitirá esclarecer estes resultados preliminares e desenhar novas metodologias para aprofundar o estudo da produção de CA endógenas por células de cancro do ovário, uma vez que novas e interessantes perspetivas se adivinham com estes achados. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que a ativação adrenérgica desempenha um papel importante na proliferação das células do cancro do ovário, muito provavelmente através dos recetores adrenérgicos β (β1 e β2), dado que, salvo uma exceção, os antagonistas utilizados reduziram a proliferação destas células, sendo o PRO (um bloqueador β não seletivo) o mais eficaz na reversão dos efeitos da AD. O CAR, o PRO e o ATE têm atualmente várias aplicações clinicas. A possibilidade de que estes e outros bloqueadores β possam ser utilizados com outros fins terapêuticos, que não os clássicos, torna-se muito atrativa para efeitos comerciais. No entanto, é necessário aprofundar o conhecimento relativamente às vias de sinalização adrenérgicas β envolvidas na proliferação de células do cancro do ovário, de forma a desenvolver novos bloqueadores β com maior seletividade para estas vias, ou aproveitar fármacos já comercializados que possam ser úteis para prevenir e/ou tratar este cancro. Novos estudos poderão assim passar por investigar as vias de sinalização implicadas nestes efeitos através da utilização de inibidores seletivos. Estudos como este podem assim contribuir para elucidar quais os bloqueadores β que de forma mais efetiva revertem os efeitos proliferativos induzidos pelas CA (libertadas excessivamente por exemplo em resposta ao stresse) em células de cancro do ovário, e que consequentemente poderão ser usados como estratégias promissoras no tratamento deste tipo de cancro. Presentemente, estão a decorrer três estudos clínicos que pretendem avaliar a segurança e a eficácia dos bloqueadores β no tratamento do cancro da mama, colorectal e do ovário que vêm assim corroborar a atualidade e o interesse do tema da nossa investigação.