Vitivirus presentes em castas portuguesas de Vitis vinifera: caraterização molecular e diagnóstico

Dissertação de mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

O impacto do complexo de doenças do lenho rugoso em Vitis vinifera ssp. L é reconhecido mundialmente. Os Vitivirus GVA e GVB estão implicados como agentes causadores desta doença. Embora haja muita informação relativa a GVA, a função da ORF 5 não está ainda bem definida, bem como a organização em grupos filogenéticos das variantes daquele vírus. Estudos indicam a presença de três ou quatro grupos filogenéticos, mas neste trabalho, as sequências obtidas alinhadas com as 12 sequências genómicas completas disponíveis em GenBank, conduziram-nos à organização em dois grupos filogenéticos principais (grupos I e II). Estabeleceu-se, ainda neste trabalho, um ensaio de tipificação RT-PCR-RFLP com uma enzima de restrição que permitiu a distinção entre os dois grupos filogenéticos determinados. A informação relativa a GVB é praticamente inexistente. Neste trabalho foram obtidas sequências de seis isolados. Este conhecimento permitiu-nos, pela primeira vez, estabelecer uma relação filogenética e agrupar as variantes caracterizadas em três grupos filogenéticos. Os domínios proteícos da proteína p10 foram investigados e detetaram-se quatro motivos de fosforilação e um de N-miristoilação. Com a informação obtida de GVA e GVB, desenhou-se um PCR-duplex, com primers específicos para cada Vitivirus. Esta ferramenta permitiu o aperfeiçoamento da deteção molecular destes vírus, de uma forma mais sensível e específica que a atual técnica de DAS-ELISA com anticorpos comerciais. Uma vez que foi verificada a presença de GLRaV-3, nos isolados de GVA e ou GVB, foi feito um ensaio de RT-PCR-RFLP para tipificação das variantes daquele virus presentes nas co-infeçoes. Verificou-se que as variantes do grupo filogenético 1 de GLRaV-3 tinham uma incidência de 80%. Este trabalho permitiu a obtenção de informação acerca das variantes destes Vitivirus, em castas portuguesas, contribuindo para um melhoramento da caracterização filogenética e funcional de GVA e GVB, em diferentes regiões genómicas, bem como o desenvolvimento de novas ferramentas destes vírus.