Ecological niche modeling, cytogenetics and phylogeography of the genera Geomalacus and Letourneuxia (Gastropoda, Pulmonata) from the Iberian-Moroccan region

First described more that 150 years ago, the systematics of the genera Geomalacus and Letourneuxia (Arionidae, Gastropoda, Pulmonata) is still challenging. The taxonomic classification of arionid species is based on extremely labile characters such as body size or color that depends both on diet and environment, as well as age. Moreover, there is little information on the genetic diversity and population structure of the Iberian slugs that could provide extra clues to disentangle their problematic classification. The present work uses different analytical tools such as habitat suitability (Ecological Niche Modeling - ENM), cytogenetic analysis and phylogeography to establish the geographical distribution and evolutionary history of these pulmonate slugs. The potential distribution of the four Geomalacus species was modeled using ENM, which allowed the identification of new locations for G. malagensis, including a first report in Portugal. Also, it was predicted a much wider distribution for G. malagensis and G. oliveirae than previously known. Classical cytogenetic analyses were assayed with reproductive and a novel use of somatic tissues (mouth and tentacles) returning the number of chromosomes for the four Geomalacus species and L. numidica (n = 31, 2n = 62) and the respective karyotypes. G. malagensis and L. numidica present similar chromosome morphologies and karyotypic formulae, being more similar to each other than the Geomalacus among themselves. We further reconstructed the phylogeny of the genera Geomalacus and Letourneuxia using partial sequences of the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I (COI) and the nuclear ribosomal small subunit (18S rRNA), and applied an independent evolutionary rate method, the indicator vectors correlation, to evaluate the existence of cryptic diversity within species. The five nominal species of Geomalacus and Letourneuxia comprise 14 well-supported cryptic lineages. Letourneuxia numidica was retrieved as a sister group of G. malagensis. G. oliveirae is paraphyletic with respect to G. anguiformis. According to our dating estimates, the most recent common ancestor of Geomalacus dates back to the Middle Miocene (end of the Serravallian stage). The major lineage splitting events within Geomalacus occurred during the dry periods of the Zanclean stage (5.3-3.6 million years) and some lineages were confined to more humid mountain areas of the Iberian Peninsula, which lead to a highly geographically structured mitochondrial genetic diversity. The major findings of this are the following: (1) provides updated species distribution maps for the Iberian Geomalacus expanding the known geographic distribution of the concerned species, (2) unravels the cryptic diversity within the genera Geomalacus and Letourneuxia, (3) Geomalacus oliveirae is paraphyletic with G. anguiformis and (4) Letourneuxia numidica is sister group of G. malagensis.

Apesar de inicialmente descritos há mais de 150 anos, a sistemática dos géneros de lesmas terrestres Ibero-Marroquinas Geomalacus e Letourneuxia (Arionidae, Gastropoda, Pulmonata), continua a não ser consensual. A classificação taxonómica das espécies da família Arionidae é baseada em caracteres plásticos, tais como o tamanho do corpo e a coloração do tegumento, que dependem não só da dieta e do ambiente mas também da idade dos indivíduos. Para além disso, informação que poderia auxiliar na problemática da classificação destes organismos, como a diversidade genética e estrutura populacional, é bastante escassa. No presente trabalho foram utilizadas diferentes ferramentas de análise tais como modelação de nicho ecológico (ENM), análises de citogenética e filogeografia, para actualizar a distribuição geográfica conhecida e desvendar a história evolutiva destas lesmas terrestres. A distribuição potencial das quatro espécies de Geomalacus (G. maculosus, G. oliveirae, G. anguiformis e G. malagensis) foi modelada usando ENM. Os resultados permitiram identificar novas localizações para G. malagensis, entre elas o primeiro registo da espécie em Portugal e adicionalmente foi prevista uma distribuição mais alargada para G. malagensis e G. oliveirae do que a previamente descrita na bibliografia. Análises de citogenética clássica foram realizadas em tecidos reprodutivos e, inovadoramente, em tecidos somáticos (boca e tentáculos). As quatro espécies de Geomalacus e L. numidica apresentaram n = 31, 2n = 62 cromossomas tendo sido obtidos os respectivos cariótipos. As espécies G. malagensis e L. numidica apresentaram fórmulas cariotípicas e morfologias cromossómicas semelhantes, sendo mais próximas entre si do que G. malagensis e as restantes espécies do género. A reconstrução filogenética dos géneros Geomalacus e Letourneuxia, com sequências parciais da subunidade I do gene mitocondrial citocromo c oxidase e da subunidade ribossomal nuclear 18S. As cinco espécies de Geomalacus e Letourneuxia apresentaram 14 linhagens crípticas suportadas pelos elevados valores de ‘bootstrap’. Letourneuxia numidica apareceu como ‘grupo-irmão’ da espécie G. malagensis e G. oliveirae revelou-se parafilético em relação a G. anguiformis. De acordo com as estimativas, o ancestral comum mais recente de Geomalacus remonta ao Mioceno Médio, final do período Serravaliano. Dentro do género Geomalacus, a principal divisão de linhagens ocorreu durante as secas do período Zancleano (5.3-3.6 milhões de anos), ficando algumas linhagens restritas a áreas montanhosas mais húmidas da Península Ibérica, o que provocou uma elevada diversidade genética mitocondrial bem estruturada geograficamente. As principais contribuições deste trabalho são: (1) a actualização dos mapas de distribuição geográfica para as espécies Ibéricas do género Geomalacus, (2) a revelação de diversidade críptica dentro dos géneros Geomalacus e Letourneuxia, (3) a existência de parafilia entre Geomalacus oliveirae e G. anguiformis e (4) o posicionamento de Letourneuxia numidica como ‘grupo-irmão’ de G. malagensis.

Universidade do Algarve, Faculdade de Ciências e Tecnologia