On the solvation in lipid bilayers measured by pyrene fluorescence: thermal and molecular composition influence on equivalent polarity in lipidic mixtures

Phosphatidylcholine (PC), sphingomyelin (SM) and cholesterol (CHOL) are major constituents of mammalian cell membranes. DPPC/CHOL and DPPC/DMPC are well-known binary mixtures. POPC/CHOL, DOPC/CHOL, egg-SM/CHOL, egg-SM/POPC and egg-SM/DOPC are less studied, but also important for the comprehension of the POPC/egg-SM/CHOL mixtures. These provide complex media for which polarity is hard to access. It is mainly determined by the water penetrating the bilayer (unevenly distributed creating a polarity gradient), though the influence of the dipoles from phospholipids (e.g. –PO, –CO, –OH) and the double bond in the steroid ring of CHOL cannot be neglected. CHOL derivatives are an interesting tool to verify the influence of the double bonds in the polarization of its surroundings. Pyrene fluorescence was used to access an equivalent polarity (associated to the dielectric constant) near the lipid/water interface of lipid bilayers. POPC/CHOL and DOPC/CHOL have similar thermal behavior and variation with CHOL content, though for lower CHOL content the equivalent polarity is higher for the DOPC/CHOL mixtures. The studies with DPPC and DMPC showed that pyrene does not seem to have a marked preference for either ordered or disordered phases. For DPPC/CHOL and egg-SM/CHOL the highlight goes to the behavior of the mixtures at higher CHOL amounts, where there is a substantial change in the thermal behavior and polarity values especially for the egg-SM/CHOL mixture. Egg-SM/POPC and egg-SM/DOPC show different behavior depending on which phospholipid has a higher molar proportion. The ternary mixtures analyzed do not exhibit significant differences, though there is the indication of the existence of a more ordered environment at lower temperatures and a less ordered environment for higher temperatures. The presence of 7DHC or DCHOL in egg-SM bilayers showed a tendency for the same behavior detected upon mixing higher amounts of CHOL.

As fosfatidilcolinas (PC), esfingomielinas (SM) e colesterol (CHOL) são os principais constituintes das membranas celulares de mamíferos. A presença deste esterol numa bicamada reflete-se através de algumas modificações ao nível das propriedades da mesma, das quais são exemplo, alterações na permeabilidade, espessura da bicamada, empacotamento das moléculas, difusão lateral dos lípidos. Hoje sabe-se que a bicamada lipídica que as compõe é um meio bastante complexo. Além de apresentar um gradiente de fluidez (da zona da interface, na qual os segmentos das cadeias metilénicas estão mais ordenados, para a zona do interior hidrofóbico, onde estão mais desordenados), apresenta ainda um gradiente de polaridade (que depende maioritariamente da presença de moléculas de água, mais concentradas na zona da interface e em muito menor quantidade no interior hidrofóbico). No entanto, é bastante difícil medir a polaridade em sistemas lipídicos. Um método muito utilizado é o uso de sondas sensíveis a alterações no meio, que particionam para o interior da bicamada. Embora as grandes diferenças na polaridade se devam à entrada e saída de água da bicamada, há que ter em conta a existência de dipolos provenientes dos diversos grupos moleculares dos lípidos (e.g. grupos fosfato, carbonilo, hidroxilo) e ligações duplas (como a que se encontra no sistema de anéis do colesterol). Muitos estudos sobre bicamadas lipídicas são feitos em sistemas modelo, segundo determinadas condições experimentais, e apenas dão uma ideia geral sobre as propriedades dos lípidos em misturas. O foco principal, na maioria das vezes, está nas interações entre lípidos, de modo que o papel desempenhado pelos dipolos é geralmente negligenciado. Sistemas binários e ternários como os estudados neste trabalho, podem parecer demasiado simples, mas dada a complexidade da membrana, são um bom método para isolar as partes para tentar compreender o todo. As misturas DPPC/CHOL e DMPC/DPPC já foram extensivamente estudadas, mas misturas como POPC/CHOL, DOPC/CHOL, egg-SM/CHOL, egg-SM/POPC e egg-SM/DOPC são menos conhecidas. No entanto, são um bom ponto de partida para aumentar um pouco mais a complexidade do sistema em estudo e partir para misturas ternárias, como a mistura POPC/egg-SM/CHOL, que é conhecida como sendo a mistura canónica que mimetiza a formação de domínios lipídicos (ou “rafts”) em membranas biológicas. O uso de derivados de colesterol, também pode ser útil, no caso de se pretender uma melhor perceção sobre as interações lípido-esterol, como aconteceu neste trabalho, particularmente em relação à influência da ligação dupla do colesterol na polaridade sentida pela sonda. Para aceder à polaridade nas misturas estudadas, foi utilizada a molécula de pireno, um hidrocarboneto aromático policíclico. Muito se tem especulado acerca deste tipo de sondas e sobre a consistência dos resultados que produzem, em especial, sobre o facto da inserção de uma molécula rígida poder trazer efeitos a nível estrutural, e sobre a possível existência de movimentos transversais consideráveis, que possam de certa forma alterar os resultados. O pireno inserido na bicamada localiza-se na zona mais ordenada das cadeias metilénicas. É certo que apresenta pequenos movimentos transversais, mas segundo estudos recentes em misturas POPC/CHOL, estes parecem ser negligenciáveis, bem como os possíveis efeitos estruturais provocados pela inserção desta sonda. O facto de esta sonda proporcionar uma média da polaridade nesta zona e ainda poder reportar uma média de diferentes zonas no plano da bicamada, devido à sua difusão lateral e ainda devido à difusão lateral dos lípidos, revela-se como uma vantagem na sua utilização. Geralmente, os dados são obtidos sob a forma de uma razão entre a intensidade da primeira banda (altamente sensível à polaridade do solvente) e a intensidade da terceira banda (praticamente insensível à polaridade do solvente) do espetro de emissão do pireno (normalmente representada como ⁄). Através da escala de polaridade do pireno (baseada no efeito de Ham) é possível relacionar esta razão diretamente com a constante dielétrica de um meio. Com base nos diagramas de fases conhecidos para as misturas analisadas neste trabalho, foi possível obter um conjunto de resultados bastante completos, através da caracterização, em termos de polaridade (equivalente), de sistemas com diferentes composições lipídicas, a diferentes temperaturas. No caso das misturas que envolvem fosfolípidos insaturados, verificou-se que os perfis de variação térmica de POPC/CHOL e DOPC/CHOL são equivalentes e semelhantes aos verificados para solventes homogéneos polares. No entanto, é possível detetar diferenças na polaridade para altas concentrações de colesterol (os valores de ⁄ baixam com a adição de 40 mol% de colesterol no caso da mistura POPC/CHOL e com a adição de 20 mol% do mesmo esterol na mistura DOPC/CHOL). A mistura (quase) ideal entre DPPC e DMPC revelou que a sonda parece não ter uma preferência marcada por fases mais fluidas ou fases mais ordenadas, sendo que esta poderá depender da composição da bicamada. Para as misturas de fosfolípidos saturados com colesterol, a análise dos resultados é um pouco mais complexa. No entanto, observa-se um comportamento semelhante para as duas misturas (embora com valores de polaridade, no geral, ligeiramente mais elevados para a mistura DPPC/CHOL): para baixas concentrações de colesterol, obtiveram-se resultados parecidos aos correspondentes às fases fluidas, e um comportamento semelhante a solventes homogéneos polares; aumentando a quantidade de esterol, os valores de ⁄ passam a não depender da temperatura, ou a depender de forma inversa (que é o caso da mistura egg-SM/CHOL). As misturas fosfolípido-fosfolípido estudadas mostram que os perfis de variação da polaridade com a temperatura dependem de qual dos fosfolípidos está em excesso. No caso das misturas ternárias, verificou-se que não há diferenças significativas entre os valores de polaridade para cada composição escolhida, no entanto, a variação térmica aponta no sentido da existência de uma fase mais ordenada a baixas temperaturas e uma fase menos ordenada a elevadas temperaturas. Por sua vez, os efeitos da adição de 7DHC ou DCHOL à egg-SM, verificaram-se, de um modo geral, como sendo semelhantes aos efeitos do colesterol. Deste modo, o comportamento da mistura egg-SM para elevadas concentrações de colesterol pode não ser um efeito específico da presença da ligação dupla.

Universidade do Algarve, Faculdade de Ciências e Tecnologia