Identification of reliable reference genes for quantitative gene expression in the Mozambique tilapia, Oreochromis mossambicus

Dissertação de mest., Biologia Marinha (Aquacultura), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010

A importância na análise de expressão genética tem vindo a crescer significativamente nas últimas década, sendo o real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) o método por excelência devido à sua grande eficiência e precisão. Um dos requisitos para medir a expressão genética através do qRT-PCR é utilização de um ou mais genes de referência, que funcionam como controlos internos para eliminar factores de variação inerentes a este método. Embora os genes de referência sejam a melhor ferramenta para a normalização, um dos grandes constrangimentos que se tem vindo a verificar é que cada vez mais estudos são reportados em que demonstram que muitos dos genes de referência até agora utilizados, são regulados em algumas circunstâncias tais como em diferentes estados de desenvolvimento ou em resposta a diferentes tratamentos. Indicando assim que não existe um gene de referência universal que tenha uma expressão constante em todas as células e diferentes situações. Neste estudo avaliámos a expressão genética de 10 possiveis genes de referência (18S RNA ribossomal, β-actina, HPRT-1, GADPH, Tubulina A, proteína de ligação TATA, factor de alongamento alpha 1, Beta-2 microglobulina, Catepsina D e Catepsina Z) através de qRT-PCR, em 13 tecidos de indivíduos adultos da espécie Oreochromis mossambicus e em cinco grupos de ovocitos em desenvolvimento de fêmeas desta espécie. A selecção de genes de referência é considerado um problema circular, já que mesmo estes genes precisam de ser normalizados. Diversas ferramentas informáticas baseadas em algoritmos têm sido desenvolvidas para contornar este problema. Duas destas ferramentas são os programas geNorm e Normfinder, os quais foram utilizados neste trabalho para analisar os dados fornecidos pelo qRT-PCR com a finalidade de validar a estabilidade destes genes e para permitir a determinação do(s) mais adequado(s). A análise efectuada por estes programas revelou que os genes mais estáveis ao longo dos tecidos foram os genes 18S RNA ribossomal, factor de alongamento alpha 1, Beta-2 microglobulina e o proteína de ligação TATA, e que nos cinco grupos de ovocitos em desenvolvimento foram os genes β-actina, factor de alongamento alpha 1 e Catepsina D. Outra conclusão obtida neste estudo foi o facto de o gene GADPH, muito usualmente usado como gene de v referência revelar-se pouco recomendado para a normalização no nosso caso, já que foi o gene que revelou uma maior variabilidade genética quer nos tecidos como nos ovocitos. Para testar e comparar o(s) gene(s) de referência apontados por estes dois programas, estes foram utilizados para a normalização da expressão genética de duas proteínas morfogenéticas ósseas antagonistas, BAMBI e Gremlin, nos cinco grupos de ovocitos em desenvolvimento. O teste revelou que o programa geNorm apresentou resultados mais satisfatórios que o programa Normfinder e que se deverá utilizar para a melhor normalização o conjunto de quatro genes CTSD, B-actin, EFa1 e CTSZ .