Oxidation and glycoxidation of phosphatidylserine and their effect in immune response : a lipidomic approach

Phosphatidylserine (PS) is a member of the class of phospholipids, and is distributed among all cells of mammalians, playing important roles in diverse biological processes, including blood clotting and apoptosis. When externalized, PS is a ligand that is recognized on apoptotic cells. It has been considered that before externalization PS is oxidized and oxPS enhance the recognition by macrophages receptors, however the knowledge about oxidation of PS is still limited. PS, like others phospholipids, has two fatty acyl chains and one polar head group, in this case is the amino acid serine. The modifications in PS structure can occur by oxidation of the unsaturated fatty acyl chains and by glycation of the polar head group, due to free amine group, thus increasing the susceptibility to oxidative events. The main goal of this work was to characterize and identify oxidized and glycoxidized PS, contributing to the knowledge of the biological role of oxidation products of PS, as well as of glycated PS, in immune and inflammatory processes. To achieve this goal, PS standards (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho- L-serine (POPS), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DPPS), 1- palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (PLPS) and 1-palmitoyl-2- arachidonoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (PAPS)) and glycated PS (PAPS and POPS) were induced to oxidize in model systems, using different oxidant reagents: HO• and 2,2'-azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride (AAPH) . The detailed structural characterization of the oxidative products was performed by ESI-MS and MS/MS coupled to separation techniques such as off line TLC-MS and on line LC-MS, in order to obtained better characterization of the larger number of PS and glycated PS oxidation products. The results obtained in this work allowed to identify several oxidation products of PS and glycated PS with modifications in unsaturated fatty acyl chain. Also, oxidation products formed due to structural changes in the serine polar head with formation of terminal acetamide, terminal hydroperoxyacetaldehyde.and terminal acetic acid (glycerophosphacetic acid, GPAA) were identified. The mass spectrometric specific fragmentation pathway of each type of oxidation product was determined using different mass spectrometry approaches. Based on the identified fragmentation pathways, targeted lipidomic analysis was performed to detect oxidation products modified in serine polar head in HaCaT cell line treated with AAPH. The GPAA was detected in HaCaT cells treated with AAPH to induce oxidative stress, thus confirming that modifications in PS polar head is possible to occur in biological systems. Furthermore, it was found that glycated PS species are more prone to oxidative modifications when compared with non glycated PS. During oxidation of glycated PS, besides the oxidation in acyl chains, new oxidation products due to oxidation of the glucose moiety were identified, including PS advanced glycation end products (PSAGES). To investigate if UVA oxidative stress exerted changes in the lipidome of melanoma cell lines, particularly in PS profile, a lipidomic analysis was performed. The lipid profile was obtained using HILIC-LC-MS and GC-MS analysis of the total lipid extracts obtained from human melanoma cell line (SKMEL- 28) after UVA irradiation at 0, 2 and 24 hours. The results did not showed significant differences in PS content. At molecular level, only PS (18:0:18:1) decreased at the moment of irradiation. The most significant changes in phospholipids content occurred in phosphatidylcholines (PC) and phosphatidylinositol (PI) classes, with an increase of mono-unsaturated fatty acid (MUFA), similarly as observed for the fatty acid analysis. Overall, these data indicate that the observed membrane lipid changes associated with lipogenesis after UVA exposure may be correlated with malignant transformations associated with cancer development and progression. Despite of UVA radiation is associated with oxidative damage, in this work was not possible observe oxidation phospholipids. The anti/pro-inflammatory properties of the oxidized PLPS (oxPLPS) versus non-oxidized PLPS were tested on LPS stimulated RAW 264.7 macrophages. The modulation of intracellular signaling pathways such as NF-kB and MAPK cascades by oxPLPS and PS was also examined in this study. The results obtained from evaluation of anti/pro-inflammatory properties showed that neither PLPS or oxPLPS species activated the macrophages. Moreover only oxidized PLS were found to significantly inhibit NO production and iNOS and il1β gene transcription induced by LPS. The analysis at molecular level showed that this was the result of the attenuation of LPS-induced c-Jun-N-terminal kinase (JNK) and p65 NF-kB nuclear translocation. Overall these data suggest that oxPLPS, but not native PLPS, mitigates pro-inflammatory signaling in macrophages, contributing to containment of inflammation during apoptotic cell engulfment. The results obtained in this work provides new information on the modifications of PS, facilitating the identification of oxidized species in complex samples, namely under physiopathologic conditions and also contributes to a better understanding of the role of oxPS and PS in the inflammatory response, in the apoptotic process and other biological functions.

A fosfatidilserina (PS) é um fosfolípido que se encontra em todas as células de mamíferos e desempenha um papel importante em processos biológicos, tais como, a coagulação sanguínea e a apoptose. A externalização da PS em células apoptóticas é reconhecida pelos recetores dos macrófagos, sendo uma via de sinalização essencial para a eliminação destas células. Nos últimos anos, tem sido proposto que a externalização da PS pode estar associada oxidação, e que a PS oxidada (oxPS) parece ser mais facilmente reconhecida pelos macrófagos do que a PS não oxidada. No entanto as modificações geradas pela oxidação da PS, assim como os seus efeitos biológicos são ainda pouco conhecidas. A PS, tal como outros fosfolípidos, pode ser facilmente oxidada em especial quando tem na sua composição ácidos gordos polinsaturados. Por outro lado, o grupo amina livre do aminoácido serina do grupo polar da PS pode sofrer glicação por reação com o grupo carbonilo da glucose, aumentando assim a sua suscetibilidade à oxidação. O principal objetivo deste trabalho foi caracterizar e identificar produtos de oxidação e glicação de PS e desta forma contribuir para a compreensão do seu papel biológico especialmente na resposta imune e inflamatória. Para alcançar o objetivo proposto, procedeu-se à oxidação da PS. Para este fim, foram selecionados compostos modelo de PS com diferentes composições de ácidos gordos: 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS); 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (DPPS); 1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero- 3-fosfo-L-serina (PLPS) e 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (PAPS). De modo a completar o estudo procedeu-se também à oxidação da PAPS e POPS glicadas. As reações de oxidação foram realizadas em sistemas modelo usando diferentes reagentes oxidantes: HO• e dicloridrato de 2,2’-azo-bis- (2-amidinopropano) (AAPH). A caracterização estrutural detalhada dos produtos obtidos nas diversas reações foi realizada por espectrometria de massa (MS) com ionização por electrospray (ESI) ESI-MS e por espectrometria se massa tandem (MS/MS) acoplada a técnicas de separação como cromatografia de camada fina (TLC) (off-line TLC-MS) e cromatografia líquida (LC) (on line LC-MS). Os resultados obtidos neste trabalho permitiram identificação dos vários produtos de oxidação de PS e PS glicada, observando-se modificações na cadeia acilo insaturada. Observaram-se também produtos de oxidação formados devido a alterações estruturais no grupo polar com formação de produtos com terminais: acetamida, hidroperoxiacetaldeido e ácido acético (ácido glicerofosfoacetico, GPAA). A caracterização por MS/MS permitiu identificar as vias de fragmentação específicas de cada tipo de produto de oxidação. Com base nas vias de fragmentação identificadas anteriormente, foi realizada uma análise de lipidómica direcionada “targeted lipidomic” para detetar os produtos resultantes da oxidação do grupo polar da PS em queratinócitos HaCaT tratados com AAPH, como estímulo de stress oxidativo. Com esta abordagem direcionada foi possível detetar derivados GPAA nos extratos lipídicos obtidos destas células HaCaT, confirmando a possibilidade de oxidação de cabeça de PS em sistemas biológicos. Os estudos de oxidação de PS glicadas mostraram que as PS glicadas oxidam mais facilmente que as suas congéneres não glicadas. Durante a oxidação de PS glicada, além da oxidação nas cadeias acilo foram identificadas novos produtos de oxidação devido a degradação oxidativa na molécula de glucose ligada á PS, identificados como PS-AGES (do inglês, PS- Advanced glycation end products). Com o objetivo de investigar o efeito da radiação UVA na membrana fosfolipídica e, em particular, no perfil de fosfatidilserinas, foi realizado um estudo com linhas celulares de melanoma (SK-MEL-28). Após a exposição à radiação UVA das linhas SK-MEL-28, os extratos lipídicos foram analisados por LC-MS e MS/MS e GC-MS. Os resultados não revelaram diferenças significativas no teor de PS após a exposição. A nível molecular, apenas a PS (18:0/18:1) diminuiu no momento da irradiação, sugerindo algum dano oxidativo, mas que foi revertido nos tempos seguintes. As mudanças mais significativas no teor de fosfolípidos ocorreram nas classes da fosfatidilcolina e fosfatidilinositol, observando-se um aumento da concentração relativa de ácidos gordos monoinsaturados (MUFA). As alterações observadas nos lípidos parecem estar relacionadas com a lipogénese e com desenvolvimento e progressão do cancro. Curiosamente, apesar do UVA estar associado ao dano oxidativo, não foi possível observar neste estudo a presença fosfolípidos oxidados. Para o estudo das propriedades anti- e pró-inflamatórias da PLPS oxidada (oxPLPS) e PLPS não oxidados foi avaliada a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos na presença e na ausência do estímulo inflamatório, o lipopolissacarídeo (LPS). Os resultados obtidos mostraram que não houve alteração na produção de NO em macrófagos estimulados com PS e oxPS na ausência de LPS. Por outro lado observou-se que no caso de macrófagos estimulados com LPS, o oxPLPS inibiu significativamente a produção de NO induzida por LPS, enquanto que o PLPS não mostrou qualquer efeito significativo. A nível molecular, observou-se que a diminuição de NO foi mediada pela inibição da fosforilação da c-Jun-N-terminal quinase (JNK) e na translocação nuclear do p65 NF-kB. Em geral estes dados sugerem que oxPLPS, mas não PLPS, reduz a sinalização pró-inflamatória em macrófagos, contribuindo para a contenção de inflamação durante apoptose celular. Os resultados obtidos nesta dissertação fornecem nova informação sobre as modificações da PS, facilitando a sua identificação em amostras complexas, nomeadamente em condições fisiopatológicas e também, informação que permite uma melhor compreensão sobre o papel da oxPS e PS na resposta inflamatória, no processo de apoptose e em outras funções biológicas.

Doutoramento em Bioquímica