Caracterização da estrutura populacional de isolados de Escherichia coli provenientes de suiniculturas de produção intensiva e extensiva de Portugal

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Escherichia coli é uma bactéria pertencente à numerosa família Enterobacteriaceae. Está normalmente associada a infeções do trato urinário, meningites do recém-nascido, infeções intestinais e septicemia. E. coli constitui também uma das bactérias mais prevalentes na flora intestinal dos animais e do Homem, sendo por isso frequentemente usada como indicador da pressão seletiva causada pelo uso de antibióticos no Homem e nos animais, com especial ênfase em animais para consumo humano. Dados recolhidos na Europa demonstram que há uma elevada ocorrência de estirpes de E.coli consideradas comensais provenientes tanto do Homem como de animais resistentes a vários antibióticos. Os isolados de E.coli pertencentes aos grupos filogenéticos A e B1 são tradicionalmente considerados comensais. Contudo, cada vez mais têm sido associados a infeções extraintestinais tal como acontece nos grupos de maior virulência B2 e D. O presente trabalho tem como objetivo principal caracterizar a estrutura populacional de isolados de E.coli provenientes de suiniculturas portuguesas, avaliar a sua resistência a antibióticos frequentemente usados clinicamente e relacionar essas resistências com a virulência tipicamente associada aos grupos filogenéticos, pois ainda são escassos os estudos neste nicho. É também objetivo deste estudo contribuir para a melhoria de estratégias de prevenção e controlo da transmissão da resistência aos antibióticos ao Homem, quer pela cadeia alimentar, quer através do ambiente, diminuindo desta forma os riscos para a Saúde Pública. Para isso, foram analisados 155 isolados bacterianos, provenientes de amostras de animais e do ambiente (águas, ar, rações, entre outras) de uma suinicultura Portuguesa de produção intensiva, e outra de produção extensiva. Depois de realizada a extração do DNA bacteriano nos isolados analisados, identificou-se a presença de E. coli por PCR. Para os isolados identificados E. coli, procedeu-se a um PCR multiplex para determinação do grupo filogenético, tendo os produtos de PCR sido analisados por electroforese em gel de agarose. Efetuou-se ainda a análise da suscetibilidade aos antibióticos dos isolados de E. coli através do método de difusão por discos, tendo sido testados antibióticos pertencentes a diferentes classes. Dos 155 isolados bacterianos analisados foram identificados como sendo E. coli 103 isolados (66%). Foi ainda observado que os isolados provenientes das duas suiniculturas estudadas foram mais frequentemente resistentes aos antibióticos espectinomicina (100%), neomicina (95%) e estreptomicina (85%). De uma forma geral, foram registadas maiores percentagens de resistência na suinicultura de produção intensiva. O grupo filogenético A é predominante no total de isolados considerados resistentes. Embora em menos quantidade, o filogrupo D aparece associado a isolados de E. coli resistentes a quase todos os antibióticos analisados. As suiniculturas portuguesas parecem assim ser potenciais reservatórios de bactérias virulentas e com resistências a antibióticos de uso clinico Humano e possivelmente de genes de resistência a antibióticos com elevada capacidade de dispersão. O tema da resistência aos antimicrobianos é um assunto de elevada importância, contudo é uma área que ainda tem uma grande lacuna, sobretudo no papel dos animais na epidemiologia da resistência a antibióticos, sendo necessário realizar mais estudos para que seja possível implementar medidas eficazes no controlo de resistências a antibióticos. Escherichia coli is a bacteria part of the numerous family known as Enterobacteriaceae. It is normally associated with urinary tract infections, newborn meningitis intestinal infections and septicemia. E. coli is also one of the most prolific bacteria both in men’s and animal’s intestinal flora, which is why it is frequently used as an indicator of the selective pressure caused by the use of antibiotics in men and animals, especially when it comes to the production of animals for human consume. Data gathered around Europe shows a high occurrence of E.coli commensal strains present in men and animals which are resistant to various antibiotics. E.coli isolated belonging to phylogenetic groups A and B1 are traditionally considered to be commensal. Nevertheless, they have increasingly been associated with extra-intestinal infections, something common among the more virulent groups B2 and D. The main objective of this study is to characterize the population structure of E.coli isolated obtained from Portuguese pig farms, evaluate their resistance to some of the most clinically used antibiotics and to relate those resistances with the virulence showed by the phylogenic groups, as there are very few studies on the matter. This study also intends to define strategies or enhance those already in place in order to help prevent the transmission of resistances to men, may it be through the food chain or the environment, ultimately decreasing public health’s risks. With that aim in mind, 155 bacteria isolated were analyzed using samples of animals and the environment (water, air, rations, among others) belonging to an intensive production Portuguese pig farm and another one of extensive production. After extracting bacterial DNA from the isolated, it was possible to identify the presence of E. coli by PCR. For the identified E. coli isolated it was done a PCR multiplex to determine the phylogenic group, including the analysis of every single PCR product by the way of agar gel electrophoresis. It was also conducted the susceptibility analysis of the E. coli isolated through the disc diffusion method (Kirby – Bauer method), with different classes antibiotics being tested. Of the 155 bacterial isolated analyzed, 103 isolated (66%) were identified as being E. coli. Additionally, it was also observed that the isolated originating from the two studied pig farms were frequently more resistant to the spectinomycin antibiotic (100%), neomycin (95%) and streptomycin (85%). In general, higher percentages of resistance were recorded in the intensive production pig farm. The phylogenetic group A is predominant in the total number of isolated considered to be resistant. Although in a lesser quantity, phylogenetic group B appears associated to E. coli. isolated resistant to almost all antibiotics tested. Portuguese pig farms seem to be potential virulent bacteria repositories with resistance to human clinic antibiotics and possibly also repositories of antibiotic resistant genes with high capacity of dispersion. The theme of antimicrobial resistance is a matter of huge importance but still an area with a lot to discover, mainly in the role played by animals in the epidemiology of antibiotic resistance. It is necessary to conduct more studies in order to make it possible to implement efficient measures in the control of antibiotic resistances.