Identyfikacja domen WG/GW zaangażowanych w wiązanie białek Argonaute oraz analiza mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za ich zmienność

Wydział Biologii: Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii

Opracowano trzy metody adnotacji białek zawierających domenę wiążącą AGO, które zaimplementowano w formie ogólnodostępnych aplikacji internetowych i/lub programów typu desktop (program Agos, Wsearch i i-Wsearch). Zaprezentowano listę wraz z oceną wiarygodności nowych rodzin białkowych zawierających domenę WG/GW we wszystkich domenach życia oraz wirusach. Aktywność wiązania AGO została już potwierdzona eksperymentalnie w trzech zidentyfikowanych białkach (SDE3, WGRP1, hnRNP). Wykazano, że mimo wysokiego zróżnicowania długości i stopnia zachowania sekwencji domen WG/GW, ich specyficzna kompozycja aminokwasowa jest zachowana u wszystkich organizmów eukariotycznych. Ponadto domeny te składają się z wielokrotnie, powtórzonych motywów długości 10-20 reszt aminokwasowych, wewnątrz których znajduje się reszta Trp otoczona hydrofilowymi resztami. 4. Zidentyfikowano wpływ mechanizmów molekularnych warunkujących zmienność domen wiążących AGO. Oprócz tandemowych i segmentowych duplikacji oraz alternatywnego splicingu, fragmenty sekwencji kodujące motywy WG/GW znajdują się pod działaniem pozytywnej selekcji przyspieszającej utrwalanie substytucji aminokwasowych, które dodatkowo podlegają licznym przetasowaniom między paralogami na drodze częstych rekombinacji i nierównego crossing-over. Ponadto zarówno zwierzęce, jak i roślinne domeny wiążące AGO, występujące w różnych rodzinach białkowych, powstają z regionów białek IDP, obejmujących także regiony glicynobogate.

In this study I designed three computational methods for identification of WG/GW domain-containing Argonaute-binding proteins. These methods were implemented as freely available web services and/or standalone programs (Agos, Wsearch, i-Wsearch). I presented a list of new proteins bearing potential AGO-binding sites as well as statistical quantification of the predictions’ quality. The experimetnal validation of three selected proteins (SDE3, WGRP1, hnRNP) strongly supports the output of this bioinformatics screen. Computer simulations of domain-swapping experiments between plant and animal AGO-binding proteins from different unrelated families revealed that their amino acid usage is evolutionarily conserved. In addition, AGO-binding domains, though significantly variable in sequence and length, are composed of repeated, usually tendemly, sequence motifs that spans from 10 to 20 aa, placing Trp residue at the center of the hydrophilic and charged face. I also showed a number of distinct intragenic and intergenic mechanisms responsible in shaping the versatile character of the domain within the RRM-WG/GW gene family. As in the case of many other multigene families, large-scale and tandem gene duplications, as well as alternative splicing are common processes that are responsible for diversification of the repertoire of subsequent regions within WG/GW domains. Subsequent to duplication, the domain evolved under positive directional selection and has undergone widespread sequence exchange events through recombination and unequal crossing over in which WG/GW motifs are frequently reshuffled among duplicated genes of the RRM-WG/GW family. Moreover, WG/GW domains present in different protein families from plants and animals differentiate from IDP proteins including glycine-rich proteins.