牙鲆rag基因的克隆及表达研究

牙鲆在中国北方沿海地区形成了大规模的工厂化养殖，成为我国海水养殖的一大重要产业。然而疾病的频繁发生严重阻碍了这一产业的发展，为了保证牙鲆产业稳定、健康、持续地发展，开展鱼类免疫系统的基础研究，提高鱼类抵抗病原菌侵害的能力，本研究从牙鲆免疫系统的个体发育过程入手，克隆了其rag（recombination activating gene）基因，在此基础上对其组织特异性表达进行了分析。 研究结果表明牙鲆rag1基因由4个外显子和3个内含子组成，第一个外显子位于5’非翻译区，这一外显子存在两种不同的剪切方式。牙鲆rag1基因编码1068个氨基酸。牙鲆rag2基因的编码区序列长为1602 bp，编码533个氨基酸，没有在牙鲆rag2基因编码区内发现内含子的存在。rag基因间序列长为3128 bp，两个基因共用一段3’非编码区。 本试验通过RT-PCR检测发现，牙鲆的rag1和rag2基因在头肾和体肾中均有表达。整装原位杂交结果表明，牙鲆在受精后第8天开始起有rag1和rag2基因的表达，主要在胸鳍前面，腮背部的部位表达，这个区域与后来胸腺出现的位置相一致。冰冻切片结果显示，rag是在靠近咽部的区域有表达。石蜡切片原位杂交结果显示，rag基因在胸腺中的表达显示出不均一性，着色较深的为皮层区，而着色比较浅的为髓部。 将牙鲆rag1基因的一部分（编码559个氨基酸）和rag2全基因序列（编码533个氨基酸）插入到表达质粒pProEXTM HTa上，在大肠杆菌E. coli BL-21中进行体外表达与分析，结合BD TALONTM Metal Affinity Resins亲和柱纯化了RAG2蛋白。