GUS基因在优化海带表达系统中的应用

本文研究了如何应用GUS基因优化海带表达系统。首先研究了GUS在各种海带材料中的本底值，而后以GUS基因作为报告基因比较了几种基因工程常用启动子在海带中启动瞬间表达的效率。选择表达效率较高的真核藻类启动子与GUS基因融合，在海带中获得了稳定表达的结果。分别用组织化学染色法和荧光分析法对海带雌配子体、雄配子体、孤雌生殖海带幼孢子体和二倍体海带孢子体等四种不同的材料的GUS本底进行了检测到GUS本底。荧光分析法所得数据显示，这四种材料的GUS活性分别为3.4±0.3、5.2±0.8、14.4±1.8、12.5±1.4 (pmol MU mg~(-1) protein min~(-1))，与高等植物类似，说明GUS基因可作为报造基因用于海带基因工程研究。选用真核藻启动子FCP启动子、高等植物基因工程中常用的高效Ubi启动子和CaMV35S启动子，与GUS基因融合构建四种质粒，通过基因松的方法转化孤雌生殖海带幼孢子体，比较GUS基因在海带中的瞬间表达量。实验结果表明，与CaMV35S和FCP融合的GUS基因在海带中表达效率较高。采用基因松的方法用FCP启动子－GUS基因转化海带雌配子体，通过诱导孤雌生殖获得孤雌生殖海带幼孢子体，用组织染色法检测到了GUS活性，并从海带的总DNA扩增到了FCP启动子－GUS基因的特征条带，从而提示了FCP启动子能引导外源基因在海带中稳定表达。为了找寻高效筛选元件进行孤雌生殖海带对草丁膦的敏感性实验，用统计学的方法得出了草丁膦对不同长度孤雌海带的半致死剂量。研究发现海带全长0.5-1.6cm范围内，草丁膦的LD_(50)与海带长度不相关，同时发现浓度在2-5μg/ml狭小范围内的草丁膦对孤雌海带比高浓度具有更为明显的毒性反应。本文结果提示草丁膦抗性基因－bar基因有可能成为海带基因工程更为理想的选择标记，因为海带对草丁膦比对氯霉素和潮霉素更敏感，而后两者是目前采用的筛选压力。本文结果为海带表达系统的优化，提供了有效的报告基因、启动子和选择标记元件。