几种对虾染色体及多倍体诱导研究

本文利用染色体制片、流式细胞术、显微荧光、组织学切片、透射电镜、及荧光原位杂交等技术，从细胞遗传学角度，研究了对虾的染色体和多倍体诱导等问题。以胚胎、无节幼体、卵巢、精巢等为材料，采用空气干燥法制片，获得了刀额新对虾、凡纳对虾和细角对虾的体细胞和减数分裂染色体中期分裂相。结果表明，刀额新对虾的染色体数目为2n = 78, n = 39，核型为2n = 78 = 40M + 10SM + 14ST + 14T。凡纳对虾和细角对虾染色体数目相同，为2n = 88, n = 44。以鸡血细胞为对照，用流式细胞仪（Partec CCAII)对刀额新对虾的细胞核DNA含量进行了测定，其值为鸡血细胞的1.75倍，绝对含量为4.025pg/2c。对细角对虾、日本对虾、刀额新对虾和中国对虾的基因组大小进行了比较，发现四种对虾基因组由大到小的顺序为细角对虾、日本对虾、刀额新对虾、中国对虾，由此推导出对虾科在进化过程中DNA发生丢失的假设。应用荧光原位杂交技术研究了中国对虾18SrDNA序列和（AG）n微卫星序列在染色体上的定位。初步研究的结果发现18SrDNA序列和（AG）n序列分布在中国对虾一对染色体的端粒区域；（AG）n微卫生序列分布在5对染色体上，着丝粒和端粒区域都有分布。本文对分布在热带和亚热带的日本对虾，斑节对虾及刀额新对虾的多倍体诱导进行了研究，成功地诱导出了三种对虾的三倍体幼体，诱导率最高分别达到68.52%、59.99%、49.70%。并进一步探讨了热带对虾多倍体诱导的特点，认为对产卵温度较市制热带和亚热带对虾，冷休克的诱导效果较好。采用热休克、冷休克、CB、6-DMAP、秋水仙素及咖啡因等方法，进行了中国对虾四倍体诱导研究。通过抑制第一极体排放或抑制第一次卵裂等途径，上述方法都获得了四倍体胚胎，最高诱导率达100%。实验中优化了诱导条件，筛选了诱导方法，认为热休克方法最佳。利用显微荧光技术研究精子入卵，原核形成、移动、结合以及再分离的过程，微管、微丝的活动及纺锤体等的动态变化，有助于深入了解多倍体的诱导机理。本文在中国对虾三倍体、四倍体诱导过程中，观察了诱导处理后染色体行为的变化，进一步分析了多倍体的形成过程。实验中发现四倍体诱导中存在细胞形态的特殊变化，认为是由于诱导处理导致的中心体复制异常所致，这也是诱导率降低的主要原因。文中讨论了四倍体诱导的最佳时机的选择即选择染色体已经分开，中心体尚未复制的时刻，并由此讨论了中心体的复制事件。利用组织学切片和透射电镜观察了三倍体成虾不同时期的性腺。结果表明，中国对虾三倍体的卵巢外观上退化明显，在组织学上可分为增殖期、阻滞期和退化期，卵巢细胞的发育大多停滞在卵原细胞阶段，尚未观察到有形态成熟的卵子形成，除少数生殖细胞进入卵黄形成前期，大多数为不定性细胞。三倍体精巢形态发育和组织学结构与二倍体相近，但产生的精子数明显少于二倍体。且输精管、贮精囊也呈退化趋势。精巢中所发现的染色体数在60-80、100-120和230-250区间的非整倍体细胞所占比例很大，其原因可能是减数分裂过程中，染色体发生了丢失。在超微结构上，观察到三倍体卵巢内的卵原细胞线粒体退休。核糖体较少，内质网和高尔期体比较发达，在晚期少数卵母细胞有卵黄颗粒存在。三倍体精巢中精原细胞和精母细胞的细胞器不发达，线粒体少，高尔基体较多；滤泡腔和输精管内精子很少，大小不一。