黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达

将黑曲霉葡萄糖氧化酶 (GOD)基因重组进大肠杆菌 酵母穿梭质粒pPIC9,转化甲基营养酵母Pichiapasto risGS115 ,构建出GOD的高产酵母工程菌株。在酵母α Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下 ,黑曲霉GOD在甲基酵母中大量表达并分泌至胞外 ,经甲醇诱导 3～ 4d ,发酵液中的GOD活力可达 30～ 40u mL。SDS PAGE证实GOD在培养物上清中的含量显著高于其它杂蛋白 ,约占胞外蛋白总量的 6 0 %～ 70 % ,经QSepharoseTM FastFlow离子交换柱一步纯化即达电泳纯。重组酵母GOD比活达 42 6 6 3u mg蛋白 ,是商品黑曲霉GOD的 1 6倍。动力学性质分析表明 ,重组酵母GOD的Km 和kcat分别为 38 2 5mmol L和 34 92 6 6s- 1 ,与商品黑曲霉GOD相比 ,具有更高的催化效率。重组酵母GOD的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。