辐射联合p53基因转导对人黑色素瘤细胞系生物学效应的研究

恶性黑色素瘤具有早期高度转移潜能，尽管常常检测到野生型p53基因，却对常规放化疗高度抗拒，因此，寻求有效治疗黑色素瘤的方法十分重要。本文就如何将放射治疗与基因治疗有机结合、外源性p53对不同p53状态的黑色素瘤细胞生长抑制和辐射增敏作用，以及外源性P53蛋白对不同传能线密度（LET）射线辐照诱导肿瘤细胞死亡途径的影响做了一些粗浅研究。 首先，采用复制缺陷的重组腺病毒载体(AdCMV-p53)介导人野生型p53基因转染1 Gy X-射线预辐照的黑色素瘤细胞系A375(wt p53)和WM983a(mu p53)，RT-PCR检测mRNA水平，流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况,克隆形成率测定辐射后细胞存活率。用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP（绿色荧光蛋白）作为对照。结果显示1 Gy X-射线辐照可明显增加AdCMV-p53对A375和WM983a细胞系的基因转导效率，转导的外源性野生型P53可在两种细胞中高效表达，并诱导细胞周期G1期阻滞；单纯转导p53对A375(wt p53)细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应，但可部分诱导WM983a(mu p53)细胞凋亡；而转导p53基因48小时后给予X-射线辐射，两种细胞克隆存活率较其对照组均明显减低；外源性p53基因对WM983a(mu p53)细胞的辐射增敏作用较A375(wt p53)细胞明显。这些结果表明小剂量辐射既可有效增加腺病毒介导的p53转导，又不会对患者产生明显副作用。而且，外源性野生型p53可明显增加黑色素瘤细胞系A375(wt p53)和WM983a(mu p53)的辐射敏感性。提示p53是基因治疗黑色素瘤较好的侯选基因，也为临床上放疗联合基因治疗恶性黑色素瘤提供了实验室依据。 其次，观察了外源性P53蛋白对不同传能线密度（LET）射线辐照诱导肿瘤细胞凋亡和坏死的影响，并探讨其可能的机理。人黑色素瘤细胞系A375（wild-type p53）经携带人野生型p53基因的腺病毒载体（AdCMV-p53）感染后分别给予X-射线和碳离子束照射，采用克隆形成法测定细胞辐射敏感性，Hoechst33258和吖啶橙-溴化乙锭双染，荧光显微镜下观察细胞凋亡和死亡。结果发现：（1）高LET射线辐照时，A375细胞和转导人野生型p53基因的A375细胞（A375/p53）的辐射敏感性没有明显差异；（2）虽然辐射诱导细胞凋亡比例的增加依赖于LET，但是无论高LET或低LET，外源性P53蛋白均可有效诱导细胞凋亡。（3）高LET射线辐照时，A375细胞的坏死细胞明显高于A375/p53细胞。提示尽管高LET射线辐射对A375和A375/p53细胞的存活无明显影响，但是对细胞凋亡的诱导却部分依赖于P53蛋白的功能，提示P53蛋白可能在调节细胞死亡类型中发挥重要作用。这对临床应用高LET射线辐射联合p53基因治疗恶性黑色素瘤有一定参考意义