腺苷蛋氨酸合成酶基因的克隆、改组与表达

S-Adenosyl-L-methionhie（SAM）是一种广泛存在于各种组织和细胞中的生物小分子，它在生物体内转甲基、转硫基和转氨丙基过程中起重要作用。SAM被广泛应用于治疗肝损伤、胆汁郁积和抑郁症等疾病。为改变当前酿酒酵母发酵胞内SAM积累量低的现状，本文以提高SAM胞内积累量为目的，综合应用现代基因工程技术，开展了SAM合成酶基因的克隆、改组与表达研究。在本试验中，我们通过PCR方法扩增得到三个SAM合成酶基因soml、samZ和metK，然后分别插入psE380载体并转化E．coliBL21。通过IPTG诱导可以获得各基因的蛋白质表达。三个目的基因被分别克隆进pYEsZ并转化酿酒酵母INVScl菌株，诱导表达后，工程菌株蛋白质表达量和胞内SAM积累量都有不同程度的提高。本论文建立了一种新的基因改组方法，可以将StEP和error-pronePCR有机的结合在一起，并成功的运用该方法对soml进行基因改组。经过一轮反应过程，蛋白质表达量和胞内SAM积累量均明显增加。对改组DNA序列分析表明，该基因具有8个点突变，导致4个氨基酸变异：I20L，G120S，I213L和A354S。为了进一步促进蛋白质表达，本文采用了一步长距离反向PCR方法，调整了起始密码子ATG和核糖体识别位点之间的间距，从而大幅度提高了蛋白质表达量和胞内SAM积累量。本论文建立了一种新的基因改组方法：分组一混合法，运用该方法可以将三种独立的基因改组过程整合进一个反应体系中。这一机制尤其适用于低同源性基因间的改组。采用本机制，仅需要一轮反应就实现了对samZ和metK的改组。通过对改组基因库的筛选，我们获得了一株SAM胞内积累量提高56.3％的酿酒酵母工程菌株。本论文建立起了一种改进的重叠PCR方法（MOE-PCR），该方法可以快速、高效的实现单个基因的多点定位突变。应用这一方法，仅需要一轮反应，就成功的实现了对soml基因8个稀有密码子的改造。