抗GD2-抗CD16及IL2-m融合蛋白的构建与活性研究

神经节甘脂GD2在正常的组织细胞中很少存在，而在黑色索瘤、小细胞肺癌、等肿瘤细胞表面大量存在。因此能特异性结合神经节营脂GD2，激活肿瘤附近免疫细胞功能的基因工程融合蛋白将为上述肿瘤的治疗开辟新的途径。实验中采用重叠PCR技术，将抗神经节普脂GDZ的单链抗体和抗CD16(FcyRIIIA)分子的单链抗体用（GGGG4s）3和sGGGGs两种连接肤连接，形成两个新型的anti-GD2／anti-CD16单链双特异性抗体基因N1M1和N2M2，将重组基因分别连接表达载体PSE380和pET22b（＋），得到重组质粒PSE380-N1M1／pSE380-N2M2和pET22b（+）-N1M1／pET22b（+）-N2M2。psE380-N1M1／pSE380-N2M2转化BL21后诱导表达，表达后的单链双特异性抗体以包涵体的形式存在于细胞中。pET22b（+）-N1M1／pET22b（+）-N2M2转化大肠杆菌BL21（DE3），表达的单链双特异性抗体以可溶形式存在于细胞的周质空问。实验中选择BL21（DE3）／pET22b（+）-N1M1和BL21（DE3）／pET22b（+）-N2M2作为双」亢的生产菌株，经均匀设计优化诱导条件后，两个单链双特异性抗体nlml和n2m2的表达量均可达菌体总蛋白的30％左右，分子量分别为54KD和53KD。实验中选择经过突变改变过的人IL-2（125Ala）与抗GDZ单链抗体触合，构建了副：合蛋白基因IL-2-M，连接表达载体PSE38。，重组质粒转化BI，21菌株，得到工程菌BL21／pSE38O-IL-2-M，诱等农达后，触合蛋白IL-2-m以包涵体的形式存在于细胞中，表达量约占菌体总蛋白的30％，分子量为43KD。IISA分析表明，诱导后表达的融合蛋白可与hIL-2抗体特异性结合。采用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析纯化上述三种融合蛋自，纯度可达95％以上。用LDH法检测其对肿瘤的杀伤作月」，实验结果证明：实验构建的中．链双特异性抗体nlml和112m2均可以激活单个核细胞（PBMC），杀伤GDZ阳性肿瘤细胞：IL-2与抗GDZ单链抗体融合蛋白IL-2-m对GD2阳性肿瘤细胞也起到一定的杀伤作用；anti-GD2／anti-CD16单链双特异性抗体与融合蛋白IL-2-m联用效果史为显著。