两种抗HER2重组免疫毒素的构建与活性研究

HER2／neu基因在肿瘤中的过度表达使其成为许多肿瘤的标志分子。人肿瘤坏死因子（TNF-α）和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（Trail）对肿瘤细胞的杀伤作用使其成为前景看好的抗肿瘤药物，对它们的细胞杀伤机制研究日渐深入。但临床研究发现HER2／neu过度表达的肿瘤细胞抵制TNF-α和Trail的肿瘤杀伤作用，因此经常产生耐药现象。为了增加过度表达HER2／neu的肿瘤细胞对TNF-a的敏感性和提高HER2／neu抗体的肿瘤杀伤效应，我们将抗HER2／neu人源化单链抗体scFvC6.5与人翔F-a融合，构建了免疫毒素scFvC6.5-TNF-α，完成了该重组蛋白在大肠杆菌中的表达，产率为800μg／L菌液。经过亲和层析和柱复性，融合蛋白的纯度达95％以上。ELISA试验表明scFvC6.5-TNF-a能够特异结合HER2／neu阳性卵巢癌细胞SKO从3和乳腺癌细胞MCF-7，而不结合HERZ／neu阴性的黑色素瘤细胞A-375。MTT试验表明scFvC6.5-TNF-a能够选择性的杀伤SKOV-3和MCF-7细胞，而不影响A-375细胞的生长。同时为了增加过度表达HER2／neu的肿瘤细胞对人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（sTrail）的敏感性和提高HER2／neu抗体的肿瘤杀伤效应，我们构建了scFvC6．5与人sTrail的融合蛋白scFvC6.5-sTrail。重组子经酶切及测序证明序列正确后，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE及westem一blot鉴定，获得高水平包含体表达菌株，产率为700雌／L菌液。对表达产物进行变性、复性及纯化，SDS-PAGE结果显示纯度达95％以上。用ELISA法检测纯化后蛋白的结合活性表明融合蛋白scFvC6.5-sTrail能够特异结合HERZ／neu阳性卵巢癌细胞SKO从3、乳腺癌细胞McF-7和Trail敏感菌株MDA-MB-231，而不结合HER2／neu阴性和Trail受体阴性的黑色素瘤细胞A-375。MTT法检测其生物活性显示纯化后的scFvC6.5-sTrail蛋白对SKO从3、MCF-7、MDA-MB-231均具有细胞毒活性，并存在剂量依赖性，但对A-375细胞没有作用。细胞凋亡流式分析表明这两种免疫毒素对SKO从3靶细胞的杀伤作用是通过诱导细胞凋亡所致。提示这两种免疫毒素在抗肿瘤靶向治疗中具有潜在的应用价值。