均质分析生物器件的研究

以蛋白质为基础的分析生物器件，如传感器和生物芯片等，为人们提供了有效的分析技术平台。而蛋白质固定的均质性则是评估分析生物器件质量的一个主要指标。因此，本实验以两种蛋白质为模式蛋白研究蛋白质固定的均质性问题。通过基因操纵构建融合蛋白Protein-Linker-Cysteine。在此设计中，半胱氨酸提供的自由疏基能够在金表面形成Au一S键，在琉基修饰的玻片表面形成-S-S-键实现蛋白质的均质定向固定；Linker可减少基因修饰对蛋白质折叠的影响。构建表达载体pPIC-GOxm（GOx-Linker-Cysteine），利用原生质体转化法将其转进毕氏酵母Pichia Pastoris，采用QSepharoseTM FastFlow阴离子交换柱纯化融合蛋白。动力学性质分析表明GOxm具有与野生型葡萄糖氧化酶相类似的Km和Kcat值，电化学实验结果显示Goxm传感器具有较高的响应电流；GOxm传感器具有较好的互换性，其相对误差为9.48%，GOxw（wild type GOx）相对误差为19.98％，而传统传感器的相对误差为17.54%。原子力显微镜图像显示融合蛋白GOxm能够利用金表面的HC尸位点形成类似六边型晶格的自组装单分子层，而野生型GOxw在金表面为非特异性吸附，形成多层固定导致分子间的聚集。通过利用-S-S-和非特异性吸附，分别制成GOxm蛋白芯片和Goxw蛋白芯片。酶学显色后，通过光学信号评估芯片的均质性，结果表明Goxm能够利用-S-S-形成均质定向固定，10次重复的变异系数小于60k，而GOxw则不能形成均质固定，点阵间的变异系数变化幅度非常大，从40％到80％。构建表达载体pET-BLC，pET-BL。将其转化进大肠杆菌AD494中。原子力显微镜研究整合有磷脂和经抽提去掉磷脂的蛋白在金表面的固定。原子力显微镜图像显示融合蛋白BLC能够利用Au-S键在金表面形成均匀固定，而野生型蛋白在金表面不能形成均匀的固定。蛋白质在金表面的固定受金表面拓扑结构和磷脂的影响。以上的实验结果表明通过此种固定方法可改善分析生物器件的均质性，提高其质量。