节杆菌BT801乙内酰脲酶基因的克隆与表达

以粘粒pKC505为载体构建了节杆菌BT801的基因组文库。用功能筛选的方法从文库中筛选得到了具有乙内酞脉酶活性的阳性克隆，经过亚克隆获得了编码乙内酞脉消旋酶（HyuR）、乙内酞脉水解酶（HyuH）和N一氨甲酞氨基酸水解酶（HuC)）的新序列。将3个酶的结构基因串联置于表达质粒pQE70 T5启动子的下游实现了3个基因的活性共表达，其活性是出发菌株A. BT801的2倍。SDS－PAGE分析表明3个酶均出现蛋白表达带，其中HuR占全菌蛋白的30%以上，主要以可溶性形式存在，HuH和Huc表达量比较低。用pQE表达载体对3个基因进行了分别表达，目的蛋白均占全菌蛋白40%以上，其中HyuR和HyuC主要以可溶性形式存在，而HyuH主要以不可溶性形式存在。关键酶抑uC的比活比原始菌株提高了52倍。将乙内酞脉水解酶基因用融合表达载体pET32a进行了融合表达，硫氧还蛋白基因融合后，酶的表达量、比活和稳定性均明显提高。以乙内酞脉酶启动子为基础构建了新表达载体，将α－淀粉酶报告基因置于启动子的下游，获得了活性表达，研究发现大肠杆菌中不存在对乙内酞脉酶启动子进行调控的基因。上述工作为乙内酞脉酶在氨基酸生产中的应用、结构和功能的关系以及基因调控等研究奠定了基础。