海藻糖合成酶基因克隆及其在烟草中的转化

海藻糖－6－磷酸合成酶是酵母菌中海藻糖合成的关键酶。本项研究成功地将酵母海藻糖－6－磷酸合成酶的基因转到模式植物烟草中，上株试验表明抗逆效果良好。从筛选出的高产海藻糖酵母菌株AS2.1416中提取总RNA，分离纯化得到mRNA，在逆转录酶的作用下合成互补的cDNA。设计引物S_1P_1，S_2P_2，以cDNA为模板，通过PCR反应，扩增出约1.6kb和2.6kb大小的两个目的基因片段。即海藻糖－6－磷酸合成酶（tps1）和海藻糖磷酸酯酶（tps2）基因片段。将tps1、tps2基因克隆，并对tps1基因全序列进行分析发现，克隆片段全长15076bps，含有一个1485bps的ORF，可编码由495个氨基酸组成的蛋白质。与国外已发表的序列相比较，编码区核苷酸序列同源性为99.6%。成功地构建了携带tps1基因的植物表达载体将其转化农杆菌，以该农杆菌浸染植物叶片，利用叶盘转化法获得了转基因烟草植株。通过Southern杂交分析证明tps1基因已整合到植物染色体上；通过Northern杂交分析证明tps1基因在植物细胞内已正常转录。对基因表达产物检测结果显示每克（干重）转基因烟草叶片内海藻糖含量最高可达0.27%。对转基因植株进行上株实验，电镜观察显示，在遭受冷胁迫和冻胁迫后，转基因烟草较对照植株受伤害程度明显减弱，特别是对叶片细胞内叶绿体，线粒体等细胞器的膜结构保护作用较好。