L-异亮氨酸高产菌定向育种与代谢控制发酵

以L-异亮氨酸产生菌A_(41-3)为出发菌株，经过定向育种和与L-缬氨酸生物合成突变株原生质体融合，从中选育出一株抗α-氨基-β-羟基戊酸、S-（-2-氨基乙基-）-半胱氨酸、乙硫氨酸、异亮氨酸羟肟酸、2-噻唑丙氨酸和红霉素的亮氨酸生物合成缺陷型CN_(69-1)，通过对L-异亮氨酸生物合成代谢控制发酵条件的研究，在含葡萄糖11%，生物素100 μg/L，硫酸铵4.5%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.02%，硫胺素800 μg/L，硫酸亚铁0.004%，硫酸锰0.004%，碳酸钙2%，L-亮氨酸0.02%，pH6.8-7.0培养基中，32 ℃摇瓶发酵72h，可产生L-异亮氨酸23.6g/L。通过定向筛选缬氨酸代谢活性菌株CN_(69-8)，使缬氨酸生物合成量由8.73g/L下降至1.81g/L，L-异亮氨酸生物合成量保持在24g/L左右。在2.000L发酵罐上进行了pH值、通气量、补料等培养条件优化的研究，在适宜条件下，菌株CN_(69-8)发酵44h，L-异亮氨酸生物合成量可达20g/L以上。测定了有关菌株L-异亮氨酸生物合成关键酶苏氨酸脱氢酶、乙酰羟酸合成酶和分枝链氨基酸转氨酶性变化，结果表明，有关关键酶的活性均比出发菌株为高。通过生长谱法确定L-亮氨酸生物合成途径所缺失的酶是异丙基苹果酸脱氢酶。采用732阳离子交换树脂从发酵液中分离提取L-异亮氨酸。研究了发酵液酸化pH值、吸附体积、不同浓度洗脱剂以及单柱吸咐与双柱串联吸咐对L-异亮氨酸分离提取的影响。确定酸化pH值为2.0，以双柱串联吸咐，用0.2mol.L~(-1)氯化铵-0.1 mol.L~(-1)氨水复合洗脱分离的工艺条件，提取总收率可达45%以上。发酵产品经红外光谱，纸层析，比旋光度等项测定证明明是L-异亮氨酸。发酵中试分离提取的总收率可达40%以上，产品经检验确定为L-异亮氨酸，其质量符合《中华人民共和国药典》标准。