抗菌肽Shiva-1和CP10A的表达

抗菌肽( Antimicrobial Peptides, AMPs)是一类小分子活性肽的统称，具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤、内毒素和原生动物的作用，并且具有刺激单核细胞和嗜中性粒细胞的趋化、促进创伤愈合等生物学活性。目前几乎在所有的生物物种中都分离到了抗菌肽，而其主要产生于昆虫和两栖类动物体的分泌物。除了天然分离之外，也有许多人工合成的抗菌肽。抗菌肽的结构和作用机制独特，以两亲性α-螺旋和疏水性结构为主，大多通过引起质膜的透化而溶解微生物细胞。抗菌肽因其分子量小、抗菌谱广、抗菌活性高、耐热性强、不易产生抗药性、无致畸以及对高等生物正常细胞无毒害等优点而在新药开发等方面具有很大的优势和潜力。如今一些抗菌肽已经应用于临床、食品、农业等领域或者正处在临床实验和研究开发阶段。但抗菌肽通过天然分离或化学合成，目前尚不能满足人们的需求。因此本研究利用基因工程手段构建抗菌肽的表达载体，并尝试利用大肠杆菌和毕赤酵母表达对其表达，以期为抗菌肽的基因工程研究和大规模生产应用奠定一定的基础和进行一定的探索。 本论文根据文献已经报道的抗菌肽Shiva-1和CP10A，自行设计并通过PCR技术获得了其DNA序列并克隆于表达载体中，构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-Shiva和大肠杆菌表达载体pET-32a(+)-CP10A、pET-28a(+)-CP10A。在此基础之上，本论文进一步研究探索了这些重组表达载体的表达，成功实现了抗菌肽CP10A在大肠杆菌AD494（λDE3）菌株中的融合表达，表达产物以包涵体形式存在。在本论文的研究中，对表达的包涵体形式的融合蛋白进行了变性、Ni-NTA亲和柱层析纯化和复性研究，首次成功实现了融合蛋白TrxA-CP10A在变性条件下的纯化和复性。CP10A在大肠杆菌中的融合表达为其后续的切割和活性研究奠定了一定的基础。 本论文的研究结果为进一步探索抗菌肽的结构功能关系提供一定前提条件，也为抗菌肽的基因工程化及其开发应用奠定一定理论依据和方法学参考。