结核分枝杆菌尼克酰胺酶/吡嗪酰胺酶的研究

本研究通过一系列生物学手段系统阐述了结核分枝杆菌尼克酰胺酶/吡嗪酰胺酶（PncA酶）的生物化学特征，并鉴定了酶当中的关键氨基酸。结果表明体外表达的结核分枝杆菌PncA酶是一个分子量为22.4 KDa的单体酶，其最适pH值和温度分别为6.6 ~ 7.4和35 ~ 45 °C。电感耦合等离子原子发射光谱结果表明PncA酶是一种含有Mn2+和Fe2+的蛋白，二者的比率为1:1。通过运用高效液相色谱和耦联氨酶试验的方法对纯化的PncA酶进行了动力学分析，结果表明PncA酶拥有相同的吡嗪酰胺酶和尼克酰胺酶活性。通过定点突变得到了9个突变，圆二色谱数据证明突变并没有引起PncA酶的二级结构的改变。对这9个突变的酶活性和金属离子含量分析的结果表明，D8、K96和C138是PncA酶结合和催化底物的关键氨基酸残基，D49、H51、H57和H71是金属离子结合的关键氨基酸，而Y103和S104则有可能与底物的结合稳定有关。我们的结果也表明，尽管与Pyrococcus horikoshii PncA酶的序列同源性很高，但二者在对金属离子的结合方式上存在明显差异, 并有可能导致两者在催化机制上的差异, 值得进一步研究。 通过筛选抗吡嗪酰胺药物的临床分离结核分枝杆菌19株，并对其pncA基因序列进行测序分析。结果再一次表明结核分枝杆菌PncA酶的突变与吡嗪酰胺耐药性密切相关，检测的准确性为78.9 %，并发现了一个在16位的甘氨酸突变为丝氨酸的新突变。