大蹼铃蟾新型抗菌肽的研究

两栖类动物皮肤裸露，柔软而湿润，体表富含腺体，其皮肤分泌物含有大量的具有特殊分子结构、功能复杂多样的生物活性分子。从两栖类己经分离到的包括血管紧张素样肤，促甲状腺素释放肤，蛙啡肤，舒缓激肤样多肤，速激肤样多肤，雨蛙肤样多肽等14类多肤家族以及生物胺生物碱等。"大蹼铃蟾是两栖类无尾目的一种，是我国的一个特有物种，主要分布于中国西南，其中云南山区种群数量巨大，多生活在污水糖和沟渠中，生活环境富有大量病原体。其皮肤腺体发达，受刺激能大量分泌富含活性物质的粘液，是分离生物活性分子的优良来源。其中抗菌肤作为活性分子的一大类，在大蹼铃蟾皮肤分泌物中不断有新的发现。通过大蹼铃蟾皮肤cDNA文库的构建，并对cDNA文库中的793个长度大于500个碱基的cDNA克隆进行随机测序，得到一类新的大蹼铃蟾抗菌肤，命名为Inaximins。由4个cDNA克隆推测得到这一类的新的抗菌肤，一共可以分为5个不同的种类，分别命名为maximinS1-5。这一类由cD瓜序列推测而来的新型抗菌肤，除了maximinS1只有14个氨基酸残基组成，maXiminS2-5都由18个氨基酸残基。并且从氨基酸残基序列上分析，新的maximinS与以往分离的到的大蹼铃蟾抗菌肤InaX1in和IllaXi"inH都不具有相似性。和东方铃蟾、多彩铃蟾皮肤分泌物中分离到的bobinin和bOInininH相比较，序列上也无同源性。从cDNA的结构上看，其编码的前体蛋白呈现一种全新的排列方式。每个cDNA克隆编码的maxininS前体蛋白都是由两个部分：信号肤加上一组不同maximinS和间隔肤的不同排列。这种奇特的排列组合方式，在东方铃蟾和多彩铃蟾都未曾发现。出现这个排列方式的原因，是由于基因本身结构，或是由于mRNA的可变剪切，或是由于体细胞基因重排，都不得而知，需要进一步的研究除了maximinS1，maximinS2-5，其二级结构分析都显示出一种类似的两亲性的Q螺旋空间结构。为了检测这一类新的大蹼铃蟾的活性，maximinsl和maximinS4用人工合成的方法得到，并对其进行了抗菌肚活性的测定。活性测定的结果显示，相同条件下，maximinS1不具抗菌活性，maximinS4具有显著的抗支原体的活性。这些现象间接证明了，小分子的抗菌肤其功能可能与氨基酸序列无关，而和空间构象由更加密切的联系。由于抗菌肤maximinS是由cDNA序列推导而来，并没有直接通过生化分离方法从大蹼铃蟾皮肤中得到。为了证明maximinS确实会被大蹼铃蟾表达，设计了一系列试验，将大蹼铃蟾皮肤分泌物通过简单的分子筛分离，追踪抗菌活性，并对具有活性的组分用MALDI-TOP质谱仪分析，证明maximinS类抗菌肤确实载大谱铃蟾皮肤分泌物中存在。