大蹼铃蟾（Bombina maxima）皮肤分泌物非晶状体-晶状体蛋白与三叶因子复合物细胞生物学活性和分子作用机制

非晶状体-晶状体蛋白质(non-lens -crystallins)在脊椎动物中以一簇的基 因家族的形式存在，在各种上皮细胞中广泛表达，但对其在体内承担的功能，人 们几乎一无所知。三叶因子蛋白(trefoil factors, TFFs)主要分布在胃肠道上皮和两 栖动物皮肤表面，许多研究表明该家族的蛋白质，在粘膜保护，损伤修复和肿瘤 抑制中具有重要的作用；但是自发现以来，TFFs 一直作为孤儿配基存在，对于 其作用的机制了解得很少。人们从来没有把两个家族的蛋白质联系在一起来考虑 过。 本实验室从中国特有的两栖动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中， 分离到这两个家族的蛋白质的天然结合在一起的复合物，并命名为：非晶状体- 晶状体蛋白和三叶因子蛋白复合物（non-lens -crystallin and treifol factor complex, -CAT）。尽管在低剂量下，-CAT 已对小鼠，大鼠和兔有致死活性， 但其结构与人源的non-lens -crystallins 和TFFs 的同源性，提示了它可能在正 常的生理功能中起到重要作用，也为揭示两类重要的蛋白质的功能和作用机制提 供了可能性。本研究工作，在多种细胞株中，对-CAT 的生物学活性作了详细 的研究，并对其作用机制进行了进一步深入的探讨。 我们原代培养了人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC) ，兔主动脉内皮细胞 (RAEC)，兔心内皮细胞(REEC)；培养了多种肿瘤细胞株。-CAT 能够引起多种 贴壁细胞的脱落。-CAT 在高剂量下能够引起这些细胞的凋亡；但是在不同的 细胞株中，发生凋亡的通路可能是不同的。在低剂量下，-CAT 能够促进细胞 的迁移，对HUVEC 具有诱导伤口修复的活性。 以HUVEC 细胞为模型，我们探讨了-CAT 的作用机制。在激光共聚焦显 微镜下，观察到-CAT 诱导HUVEC 发生囊泡化，这个效应是剂量依赖的；囊 泡化的发生不依赖于NH4Cl 的存在，但是NH4Cl 能够增大囊泡化的效应。在荧 光染料Cy3 直接标记-CAT 时，观察到-CAT 被定向运输到细胞核上。荧光染 料FITC 分别标记-CAT 的轻链和重链的多克隆抗体，免疫荧光染色发现，在较 短的时间(5 min)内, -CAT 已经进入细胞，并有部分分子被运输到细胞核上。随 着时间增加到30 min，轻链和重链在核上的比例也渐增加；到2 小时，-CAT的重链全部集中在细胞核上，而-CAT 的轻链则退出核外，主要聚集在细胞核 周围。核定位显示-CAT 分子进入HUVEC 细胞核，可能在基因的转录调节中 发挥作用。我们运用基因芯片检测了加药处理前后细胞蛋白质表达水平的变化。 在四组重复实验中均显示，加入-CAT 处理后，有121 个基因发生上调，这些 基因在调节细胞的生存和死亡中具有复杂的功能。其中核受体蛋白质家族 （NR4A1 等）的变化最为明显。而其他的基因包括调节细胞早期生长，凋亡， 炎症反应的相关基因和金属蛋白酶。同时，加入-CAT 处理后，仅有2 个基因 发生下调，包括胶原I，这为解释细胞发生脱落和调亡提供了分子基础。 本研究工作揭示了非晶状体-晶状体蛋白和三叶因子蛋白的相互作用，共 同定位到细胞核上，并调节基因的转录，首次提示非晶状体-晶状体蛋白可能 参与一条全新的细胞信号调节途径，在组织平衡，肿瘤发生和胚胎发育中起到重 要的作用；同时也为三叶因子蛋白的分子作用机制的解析提供了一种新的可能 性。