滇金丝猴细菌人工染色体文库构建及Neurotrypsin基因的分子进化研究

本文包括两方面有关灵长类的研究工作。一是构建了一个非人灵长类（滇金丝猴）的人工染色体文库（BAC文库），为进一步研究灵长类的基因组进化奠定了一定的基础，二是对一个认知相关基因neuotrypsin在灵长类中的分子进化进行了详尽的研究，以期从分子进化角度认识该基因在灵长类高级认知功能发展中所起的作用。滇金丝猴（Rhinopithecusbieti），一个处于严重濒危状态的旧大陆猴，中国特产灵长类之一。在系统发育上它占据着旧大陆猴与小猿的中间地位，是研究灵长类进化的一个重要物种。，在本研究中，我们构建了一个滇金丝猴的细菌人工染色体文库（BAC文库）。该文库含有136320个BAC克隆，平均插入片段大小为148kb，小片段（50-100kb）所占的比例为2.74％，非重组克隆仅占2.67％。假定金丝猴与亲缘关系较近的灵长类有着相似的基因组大小，该文库至少有6倍的基因组覆盖率。对随机选取的BAC克隆进行末端测序，我们获得了201个序列标签（STS）。通过荧光原位杂交（FISH）技术，139个经末端测序的BAC克隆被精确定位到滇金丝猴的染色体上。荧光杂交实验还表明了人和金丝猴染色体产存在着高度的同线保守性。在人类基因组数据库中的Blast搜寻的结果显示染色体上的克隆数目与染色体大小呈很好的相关性，表明该文库克隆比较均匀地覆盖了滇金丝猴的基因组。该金丝猴文库及所定位的克隆将会成为非人灵长类的比较基因组研究和大规模基因组测序的一个宝贵的资源。Neurotrypsin是与个主要在脑中表达的，同神经发育和认知功能相关的胞外丝氨酸蛋白酶。它在人体中发生的突变与常染色体上隐性的非综合性精神发育迟缓（MR）紧密相关。我们通过对n个非人灵长类，包括大猿、小猿、旧大陆猴和新大陆猴neurotrypsin的编码区的测序，研究了neurotrypsin在灵长类中的分子进化。结果显示出，在灵长类进化过程中，neurotrypsin保持着由纯化性选择（负沟选择）所致的强烈的功能限制，这暗示着neurotrypsin在灵长类的认知发展中起着关键的功能性作用。进一步的分析表明，纯化性选择实际上只作用于neurotrypsin的介导其结合到其它细胞表面或胞外蛋白质的SRCR功能结构域上。另外，通过灵长类和其它哺乳动物目的比较，我们还发现，在鼠neuotrypsin中，一个人SRCR结构域（外显子2和3）的缺失是由于在鼠科动物中所发生的片段丢失事件所致。