毛细管电泳电化学发光的研究

毛细管电泳以其强大的分离能力日益受到重视，特别是成功完成人类基因组计划的测定工作，随着微全分析系统的深入研究，毛细管电泳的理论和技术在各方面都需要突破，其中毛细管电泳检测器是制约发展毛细管电泳更广泛地用于实际工作的因素之一。本论文以发展新型的毛细管电泳电化学发光检测技术为出发点，在以下几个方面作了研究。1．三联吡啶钌在玻碳电极上的阴极电化学发光我们首次发现了一种新型的基于溶液中氧的还原引发的三联毗淀钉（TBR）阴极电化学发光，结果表明，这种阴极电化学发光的发光电位仅为-0.4V，从而大大地降低了电化学发光的激发电位。所有能够增强阳极电化学发光的物质如三丙胺（TPA）都能够增强阴极电化学发光。阴极电化学发光光谱证实，阴极发光是激发态的TBR跃迁回到基态所产生的发光行为，我们认为在电极上氧还原所产生的活性氧氧化了TBR分子和发光增强剂从而导致了阴极发光。一些不能够增强阳极电化学发光的物质如柠檬酸，也能够增强阴极电化学发光，从而扩展了电化学发光的检测范围。采用阴极电化学方法对TPA和柠檬酸根的检测结果表明，对TPA在1*10~（-7）-1*10~（-5）M之间的检测呈较好线性相关性，相关系数为0.9994，最低检测限（S/N＝3）为7.5*10-8M，对柠檬酸根在1*10~（-5）-1*10~（-4）M之间呈较好的线性关系，相关系数为0.999，最低检测限（S/N＝3）为1.2*10~（-6）M。2．毛细管电泳直接电化学发光离柱检测技术的研究研究在没有场分离器的情况下高压电场对电化学发光检测器的影响。基于此目的我们采用75件m内径的毛细管为分离柱，300μm直径的铂丝为工作电极，以不同电导率的溶液作为电泳流动相。在高压电场的影响下，动态循环伏安和与此相对应的电化学发光表明电泳电流并不会引起电化学发光信号的淬灭，高压电场只会导致电化学发光激发电位向更正方向的偏移。进一步的研究表明，毛细管与工作电极之间的间距是影响电化学发光信号和理论塔板数的重要因素。基于以上的认识，我们发展了无需电场分离器的毛细管电泳一电化学发光检测系统，从而大大地简便了毛细管电泳一电化学发光检测系统。以三丙胺（TPA）作为分析对象，对该系统进行了表征，该系统对TPA的检测在1*10~（-10）-1*10~（-5）mol/L之间的线性相关系数为0.998，峰高的相对标准偏差为5．6％，检测限（S加＝3）达到5.0*10~(-11)mol/L。采用这一方法对尿样中的利多卡因进行了分析，在5.0*10~(-8)-1.0*10~(-5) mo/L之间的相关系数为：0.998，最低检测限（S/N＝3）为2.0*10-8mo／L。3．毛细管电泳一固态电化学发光检测器检测的研究我们首次报道将TBR固定在聚苯乙烯磺酸-溶胶-凝胶-接枝共聚物构成的膜中，采用旋涂的方法涂敷在铂电极的表面，制备用于毛细管电泳的固态电化学发光检测器，以TPA和脯氨酸作为研究对象表征了毛细管电泳-固态电化学发光检测系统的特征，该系统可以稳定工作24小时，完全可以满足实际应用的需要。采用该系统实现了对TPA和脯氨酸的同时检测，对TPA和脯氨酸检测的相对标准偏差分别为8.7％和7.5％，分离的理论塔板数分别为70000和16000，对TPA和脯氨酸的测定的最低检测限分别为0.002μM和2μM。4．离散小波分析去除毛细管电泳电化学发光检测信号的噪音毛细管电泳电化学发光检测信号因为TBR与溶液中的氢氧根的化学发光反应使得信号的噪音变得很大，从而影响了峰的定量，降低了检测灵敏度。这里我们采用离散小波'分析技术去除电泳中的噪音。对一些典型的小波基如HaaroDaublets，Coiflets和Symmlets去除噪音的效果作了比较。各种不同的计算阀值的方法和确定阀值的技术导致的去噪结果的差异作了比较。结果表明，采用Symmlet 4小波基和启发式无偏向风险估算法-软阀门确定阀值是最优的去噪方案，采用这一策略对毛细管电泳电化学发光电泳信号的去噪结果表明，噪音成功地得到了去除，同时电泳的峰型和轮廓得到了保留，该去噪技术明显地优于通常的SG和FT去噪技术。5．毛细管电泳柱端电化学发光同时检测尿样中的曲马多和利多卡因曲马多和利多卡因是手术中常用的镇静剂和麻醉剂，部分药物以原形从肾脏排除，我们研究了简单、快速的采用毛细管电泳柱端电化学发光同时检测曲马多和利多卡因的方法。我们使用25μm内径的毛细管作为分离柱，由于使用的毛细管内径很小，从而大大地降低了分离电压对检测器的影响，因此毛细管与电化学发光检侧器直接连接而无需电场分离器。使用300μm直径的铂盘电极作为工作电极，使得在毛细管的出口有足够的氧化态的TBR存在。为消除尿样中的离子强度对分析造成的影响，样品在分析前经萃取分离，以TPA为内标，采用两步萃取寻去对尿中的曲马多和利多卡因的测定回收率分别为94-96％和93-97％。在1.0*10-7to 1.0*10-4的浓度范围内曲马多和利多卡因的检测的线性相关系数为0.998，检测的相对标准偏差分别为2.9％和2.7％，对尿中曲马多和利多卡因测定的最低检测限（S/N=3）分别为6.0*10~(-8)mol/L和4.5*10~(-8)mol/L。应用该方法对临床两例术后病人尿样中的曲马多和利多卡因的代谢进行了测定。6．毛细管电泳电化学发光检测尿样中的利血平提出了一种快速、简便的毛细管电泳电化学发光法测定尿样中的利血平的方法。我们以25拼m内径的毛细管为分离柱，不用场分离器直接与300μm直径的铂二〔作电极连接，为提高检测的灵敏度和克服尿样中的离子强度对检测的影响，我于门采用场放大电动进样的技术用于毛细管电泳的直接进样和分离，样品不经任何预处理。由于利血平是中性分子，采用毛细管区带电泳不能将利血平与中性的干扰物分离出，因此我们在电泳流动相中加入十二烷基磺酸钠（SDS），成功地将利血平与中性干扰物质分离开。该方法对尿样中的利血平检测范围在l*10~(-6)~(-1)*10~(-4)mol/L 比的线性相关系数为0.996，相对标准偏差为4.3％，最低检测限为7.0*10~(-8)mol/L。