高稳定性安培生物传感器的研制

生物传感器已发展成为一种新型的分析手段，并被广泛应用于临床、环境、食品等领域。本论文从合成新型生物相容性固定化载体、寻找高稳定性的酶及建立新的有机相体系三方面对酶电极进行了研究。主要结果如下：1. 采用有机-无机杂化的方法，首次将无机玻璃材料同高分子水凝胶结合起来，制备了一种新的固定化载体。我们对其制备条件进行了优化，结果表明：正硅酸乙酯与水的最佳比率为1:4，而水凝胶有最佳含量为38.3%。这种掺杂材料一方面春服了两种材料各自的缺点，即溶胶-凝胶陶瓷材料的开裂和水凝胶的溶胀；另一方面保留了水凝胶的生物相容性和无机玻璃的物理刚性、高稳定性等优点。红外、电镜和QCM实验证明，膜中含有大量的羟基和氢键，且两种组分形成互穿网络。另外，当酶分子被包埋于溶胶-凝胶复合膜中后，没有发现酶的泄漏。2. 用此种杂化材料固定了葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶及酷氨酸酶，制备了薄膜型生物传感器。有机-无机复合膜较薄从而具有短的扩散路径，因此传感器的响应很快。另外，由于杂化膜的高生物相容性和稳定性，这些酶固定后都保持了高的生物活性，故制备的生物传感器具有高的灵敏度和好的稳定性等优点。这些证明溶胶-凝胶掺杂法是制备高稳定的生物传感器的普适方法。3. 通过双水相萃取、Mono-Q柱层析和Butylsuperose疏水层析等纯化步骤，从商品大豆的种皮中提纯了一种高稳性的大豆过氧化物酶。该酶的活力为200 pyrogallol U/mg，大大高于Sigma公司产品（130 pyrogallol U/mg)。此过氧化物酶可在从pH3-10范围内维持其活性，并且显示了不寻常的热稳定性（60 ℃时半衰期为20小时）。我们用此酶首次制备出在酸性条件下可稳定使用的过氧化氢传感器。在低的pH值时，酶电极具有快的响应，高的灵敏度和好的长期稳定性。此酸稳定传感器的提出扩展了生物传感器的应用领域。4. 发展了一种新型的可用于监测惰性有机溶剂的安培传感器。EQCM和电化学实验阐明了其机理：注入的有机溶剂富集底物探针酚，降低了酶膜中酚的浓度，故引起传感器响应的下降。因为电流的下降正比于所加入的有机溶剂的数量，因此可以用安培传感器来定量测定电化学惰性的有机溶剂。对某有机溶剂的灵敏度和检测限依赖于酶载量及固定化载体和底物探针的憎水性。该传感器可以用于废水分析和环境临测，大大地延伸了生物传感器的适用范围。5. 将生物膜与传感器技术结合起来，制备了双层磷脂膜生物传感器。采用浸涂及浇铸等新的固定化方法，将辣根过氧化物酶分别固定到双层及多层磷脂膜中，在玻碳电极上制备了过氧化氢传感器。由于生物膜所带的负电荷能排斥抗坏血酸、尿酸等阴离子物质，从而较大的消除了杂质的干扰。另外由于生物膜在电极表面上为酶提供了生物相容的微环境，故实现了辣根过氧生物酶与玻碳电极之间的直接电子转移，为制备第三代生物传感器奠定了基础。