生物活性有机锗及HPCPC双水相分离生物大分子的研究

本论文内容主要分为4个部分：“有机锗化合物抑制Maillard反应的研究”、“Ge-132对体外培养幼鼠胰岛细胞的作用研究”、“PEG／磷酸盐双水相体系中生物大分子分配的研究”和“HPCPC（High Performance Centrifugal Partition Chromatography，高效离心分配色谱）双水相体系对生物大分子分离的研究”。前两部分主要从有机锗化合物防治糖尿病及其并发症的代谢机理和细胞学角度进行研究，本文引入HPCPC和双水相体系分离生物大分子的技术，为进一步阐明有机锗化合物在Maillard反应过程中的作用机理：对双水相体系中生物大分子的分配及HPCPC在双水相体系中分离生物大分子也做了大量的基础性研究，为开发HPCPC的应用作出了有价值的探索工作。本论文的主要创新点归纳如下：一、有机锗化合物对Maillard反应的抑制作用：针对国际上有机锗发展的前沿课题，在国内首先开展了有机锗化合物对Maillard反应抑制作用的研究，取得了有价值的研究结果。1、在模拟体内的生理条件下，研究了不同浓度Ge-132对精氨酸、组氨酸、甘氨酸和缬氨酸对Maillard反应荧光峰强度的影响：不同类型的氨基酸Maillard反应产物结构上的差异和不同浓度有机锗对组氨酸糖化反应420nm处特征吸光度的影响。2、苯丙氨酸是侧链带有苯环的芳香族氨基酸，是一种具有弱的天然荧光的生物小分子，其荧光最大发射位置在281.6nm。由于aillard反应是葡萄糖和氨基酸的-NHR基发生的反应，其反应产物的特征荧光在440nm附近。这两类荧光的发射位置相差较远，相互之间没有影响，因此利用荧光法观察Phe在反应过程中自身的荧光变化和Ge-132对Phe的Maillard反应荧光产物的抑制情况。3、血清白蛋白是哺乳动物体内的重要蛋白质，可作为多种内源性、外源性物质的存储和转运蛋白，其Maillard反应已经被广泛重视，但较复杂的实验条件限制了它的研究。通过观测蛋白质Maillard反应产物特征荧光的变化是一有效的研究方法。BSA的内源性荧光是由肽链色氨酸和酪氨酸残基贡献的，其最大发射位置340nm左右。其Maillard反应产物的特征荧光在440nm附近，这两类荧光发射位置相差较远，基本上没有影响，因此能够通过荧光光谱研究BSA的Maillard反应荧光产物的情况。本文观测了Ge-132对BSA的Maillard反应荧光产物的抑制作用，同时还通过荧光法确定了一个文献中没有的新的反应位点。4、本文研究了具有更高水溶性的一类双有机锗化合物(HO)_2Ge(CHR_1CHR_2COOH)_2．2H_20抑制Maillard反应的特性，结果证明它比Ge-132具有更高的抑制作用，我们通过化合物的构效关系解释了上述作用的机制。5、本文研究了Tb(Ge-132)_3和Eu(Ge-132)_3两种含稀土的配合物对氨基酸、蛋白质Maillard反应的影响，观察了稀土离子对Maillard反应体系的影响，对实验现象作出了合理的解释。二、Ge-132对体外培养幼鼠胰岛细胞的作用为进一步考察有机锗对糖尿病的防治作用，我们与白求恩医大合作，首次观察了Ge-132对体外培养的幼鼠胰岛细胞结构和功能的影响，研究了不同剂量的含锗化合物对幼鼠胰岛细胞分泌胰岛素的作用，认为低浓度的Ge-132对胰岛细胞分泌胰岛素具有明显的促进作用。该部分内容为首次报导。三、PEG／磷酸盐双水相体系中生物大分子分配的研究双水相萃取TPE(Aqueous Two-Phase Extraction)具有下述优点：生物相容性好、界面张力低、能量低、易于工业规模的放大、可以进行连续操作等。本论文系统地研究了各种蛋白质在PEG／磷酸盐体系中的分离情况，如在各种pH条件下，从6.8到9.2，各种分子量的PEG，包括PEGl000，2000，5000，6000，10000，和20000和磷酸盐双水相体系的物化性质，以及对lysozyme（溶菌酶），BSA（牛血清白蛋白），HSA（人血清白蛋白），Hemoglobin（血红蛋白）在各种体系中的分配系数，探讨了各种因素对生物大分子分配的影响。四、HPCPC在双水相体系对生物大分子分离的研究由于荧光光谱法证实了Ge-132对牛血清白蛋白Maillard反应的抑制作用。但对于如何能够分离出糖化产物，达到进行定量表征的目的是我们研究的一个重要内容。九十年代初，由日本研制出一种色谱中新技术HPCPC。HPCPC与传统的液相色谱(LC)和高效液相色谱(HPLC)不同，不需要固体作为支持体。流动相和固定相分别为两种不相混溶的液体，通过离心力的作用使其中一相作为固定相保持在类似多级萃取器的微小分配槽中，另一相作为流动相流经固定相。HPCPC在双水相体系的应用是一种利用多级连续萃取从双水相中分离生物物质的方法它具有运行时间快、高效高选择性，流动相与固定相之间比例可以任意改变，并在任何pH值均可进行正向和反向操作并且实验室规模可一步直接放大到生产规模。它不仅可以作为一种分离的工具，而且也是一种研究生物萃取反应动力学机理，反映热力学与动力学之间相关性的重要方法。本论文中研究了常用的两种双水相体系，利用PEG6000／Dex20000／H_20对BSA和Maillard反应产生的糖化BSA进行了初步分离，取得了一些阶段性结论。另外，通过对各种条件的筛选，选择了具有代表性的lysozyme和BSA，BSA和血红蛋白(Hb)进行HPCPC色谱仪上的分离，研究了色谱分离条件如：转数、流速、pH等对分离效率及理论塔板数的影响，取得了一系列重要的结论。为工业上大规模的生物样品分离提供了重要的参数。