一氧化氮(NO)调节白皮松花粉管生长和细胞壁构建的研究

花粉管是种子植物受精过程中的雄性生殖单位载体，具有典型的顶端极性生长特点，因此成为近年来研究植物细胞间相互识别、胞内外信号传递的模式系统。裸子植物花粉管与被子植物花粉管相比具有萌发时间长、生长缓慢等特点。一氧化氮（NO）作为一个重要的胞内信号分子，参与调节植物生长发育和多种生理过程，但是，有关NO对花粉管生长的作用机制目前尚不清楚。本研究以裸子植物白皮松(Pinus bungeana)花粉为材料，应用不同浓度的NO释放剂SNAP和SNP, NO清除剂cPTIO和哺乳动物一氧化氮合酶抑制剂L-NNA处理，对白皮松花粉萌发和花粉管伸长进行了细胞学研究，从而为进一步揭示NO调控裸子植物花粉管生长机理提供参考。 本论文首先研究了NO释放剂、清除剂及NOS抑制剂对白皮松花粉萌发和花粉管生长的影响。结果显示，SNAP和SNP能够促进白皮松花粉萌发和花粉管伸长，并具有浓度效用，但对其花粉管的形态特征无明显影响；cPTIO和L-NNA能够抑制白皮松花粉萌发和花粉管生长，并且具有浓度效应，同时还可使花粉管顶端膨大呈球形，并丧失花粉管的极性生长。运用NO特异探针DAF-2DA标记显示，SNAP和SNP处理可促进花粉管胞内NO产生；经cPTIO和L-NNA处理后，花粉管内荧光强度比对照花粉管明显减弱。上述结果表明，NO参与裸子植物花粉管极性生长，并且适量NO可以促进花粉管的生长。 用显微注射技术将Ca2+特异探针注射入白皮松花粉管，以检测白皮松花粉管胞内Ca2+浓度梯度。结果显示，SNAP和SNP处理后，NO荧光增加的同时，花粉管顶端Ca2+浓度梯度增加。与此相反，cPTIO和L-NNA处理后，NO荧光降低的同时，花粉管顶端Ca2+浓度梯度也相应降低。应用非损伤微测技术测定花粉管胞外Ca2+内流，结果显示，SNAP和SNP促进胞外Ca2+内流，而cPTIO和L-NNA则抑制胞外Ca2+内流。据此，我们推测，在白皮松花粉管中，NO可能通过调节胞外Ca2+内流来调节胞内Ca2+浓度梯度，然而，我们不能排除在NO信号传递过程中，胞内Ca2+库可能影响胞内Ca2+浓度梯度。 通过微丝特异探针标记的白皮松花粉管显示，SNAP和SNP可使花粉管顶端细微丝束解聚，而cPTIO和L-NNA处理后，花粉管中微丝聚合，尤其在花粉管顶端形成粗的微丝束，并一直延伸到花粉管的最顶端。结合上述Ca2+结果，我们认为，经NO处理后，白皮松花粉管微丝骨架的动态变化，可能是通过Ca2+浓度来进行调控的。通过FM4-64探针标记显示，正常生长白皮松花粉管胞吞作用主要集中在顶端和亚顶端，并且形成倒“V”形的分布模式，SNAP与SNP处理后荧光分布模式与对照花粉管类似，但达到饱和所用时间相对较短；而L-NNA处理后顶端膨大丧失极性的花粉管，荧光分布在膨大花粉管靠近质膜的区域，未见倒“V”形分布模式；经L-NNA处理后，顶端没有膨大的花粉管，荧光几乎均匀分布于整个花粉管，并且L-NNA处理后达到饱和的时间较对照长。上述结果表明，适量NO能够促进白皮松花粉管胞吞。 免疫抗体标记技术分析发现，对照花粉管的酯化果胶质和AGPs都集中在顶端，酸性果胶质分布在侧壁，胼胝质均匀分布在整个花粉管壁上。L-NNA处理后的花粉管，在其顶端出现酸性果胶和酯化果胶，以及有胼胝质积累，而AGPs则分布在花粉管的基部。运用傅里叶红外光谱技术（Fourier Transform Infared Spectroscopy, FTIR）技术分析白皮松花粉管顶端细胞壁成分，结果显示，SNAP处理后花粉管顶端酯化果胶增加而酸性果胶降低；与之相反，经L-NNA处理后的花粉管，其顶端酯化果胶降低而酸性果胶增加。 综上所述，在白皮松花粉管中，NO促进胞外Ca2+内流，从而维持胞内Ca2+浓度梯度，进而影响花粉管顶端微丝骨架的组装，促进囊泡运输，使花粉管顶端酯化果胶累积，最终促进花粉管的正常生长。