Moonlighting Proteins of Lactobacillus crispatus : Extracellular Localization, Cell Wall Anchoring and Interactions with the Host

Moonlighting functions have been described for several proteins previously thought to localize exclusively in the cytoplasm of bacterial or eukaryotic cells. Moonlighting proteins usually perform conserved functions, e. g. in glycolysis or as chaperonins, and their traditional and moonlighting function(s) usually localize to different cell compartments. The most characterized moonlighting proteins in Grampositive bacteria are the glycolytic enzymes enolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), which function in bacteria-host interactions, e. g. as adhesins or plasminogen receptors. Research on bacterial moonlighting proteins has focused on Gram-positive bacterial pathogens, where many of their functions have been associated with bacterial virulence. In this thesis work I show that also species of the genus Lactobacillus have moonlighting proteins that carry out functions earlier associated with bacterial virulence only. I identified enolase, GAPDH, glutamine synthetase (GS), and glucose-6-phosphate isomerase (GPI) as moonlighting proteins of Lactobacillus crispatus strain ST1 and demonstrated that they are associated with cell surface and easily released from the cell surface into incubation buffer. I also showed that these lactobacillar proteins moonlight either as adhesins with affinity for basement membrane and extracellular matrix proteins or as plasminogen receptors. The mechanisms of surface translocation and anchoring of bacterial moonlighting proteins have remained enigmatic. In this work, the surface localization of enolase, GAPDH, GS and GPI was shown to depend on environmental factors. The members of the genus Lactobacillus are fermentative organisms that lower the ambient pH by producing lactic acid. At acidic pH enolase, GAPDH, GS and GPI were associated with the cell surface, whereas at neutral pH they were released into the buffer. The release did not involve de novo protein synthesis. I showed that purified recombinant His6-enolase, His6-GAPDH, His6-GS and His6-GPI reassociate with cell wall and bind in vitro to lipoteichoic acids at acidic pH. The in-vitro binding of these proteins localizes to cell division septa and cell poles. I also show that the release of moonlighting proteins is enhanced in the presence of cathelicidin LL- 37, which is an antimicrobial peptide and a central part of the innate immunity defence. I found that the LL-37-induced detachment of moonlighting proteins from cell surface is associated with cell wall permeabilization by LL-37. The results in this thesis work are compatible with the hypothesis that the moonlighting proteins of L. crispatus associate to the cell wall via electrostatic or ionic interactions and that they are released into surroundings in stress conditions. Their surface translocation is, at least in part, a result from their release from dead or permeabilized cells and subsequent reassociation onto the cell wall. The results of this thesis show that lactobacillar cells rapidly change their surface architecture in response to environmental factors and that these changes influence bacterial interactions with the host.

Laktobasillit kuuluvat maitohappobakteereihin, joita käytetään yleisesti mm. meijeriteollisuudessa sekä kasvisten ja lihan valmistuksessa käymisreaktioilla. Ne ovat osa ruuansulatuskanavan sekä virtsatiehyeiden että sukupuolielinten normaalia bakteeristoa. Laktobasilleilla on havaittu terveyttä edistäviä vaikutuksia ja joitakin laktobasilli-kantoja käytetäänkin probiootteina. Enolaasi, glyseraldehydi-3-fosfaatti dehydrogenaasi (GAPDH), glutamiinisyntetaasi (GS) ja glukoosi-6-fosfaatti isomeraasi (GPI) ovat keskeisiä solunsisäisiä aineenvaihduntaentsyymejä. Tässä väitöskirjatyössä niiden kuitenkin havaittiin sijoittuvan myös Lactobacillus crispatus bakteerin pinnalle ja erittyvän ympäristöön. Aineenvaihduntaentsyymien esiintyminen bakteereiden pinnalla on ilmiönä tunnettu, mutta aikaisemmat tutkimukset ovat keskittyneet pääsääntöisesti taudinaiheuttajabakteereihin ja näiden entsyymien ilmentyminen bakteerin pinnalla on liitetty taudinaiheutuskykyyn. Väitöskirjatutkimuksessani osoitettiin, että myös laktobasillit voivat hyödyntää näitä solun ulkopuolella esiintyviä entsyymejä vuorovaikutuksessa isännän, kuten ihmisen kanssa. Ne välittävät bakteerin kiinnittymistä isännän kudoksiin ja toimivat vuorovaikutuksessa veren hyytymisjärjestelmän kanssa. Tutkimuksessa myös verrattiin laktobasillien ja taudinaiheuttajabakteereiden enolaasi-proteiineja ja havaittiin niiden olevan hyvin toistensa kaltaisia. Maitohappobakteerit tuottavat kasvaessaan maitohappoa ja muuttavat siten ympäristönsä happamaksi. Tutkimuksessani havaittiin enolaasin, GAPDH:n, GS:n ja GPI:n tarttuvan bakteerin pintaan happamissa olosuhteissa. Ympäristön stressitekijöiden, kuten korkean pH:n tai luontaiseen immuniteettiin kuuluvien antimikrobisten peptidien havaittiin sen sijaan lisäävän proteiinien vapautumista ympäristöön. Olosuhteiden muuttuessa jälleen happamiksi, entsyymien todettiin kykenevän tarttumaan paitsi saman bakteerilajin, myös toisten laktobasilli-lajien pintaan. Myös näiden solunulkopuolisten aineenvaihduntaentsyymien välittämät vuorovaikutukset isännän kanssa ovat riippuvaisia ympäristön pH:sta. Väitöskirjatutkimukseni tuo uutta tietoa laktobasillien pintaproteiineista ja työn tulokset osoittavat, että laktobasillit muokkaavat pintarakennettaan ympäristön muuttuessa, mikä johtaa myös muutoksiin bakteeri-isäntä vuorovaikutuksessa.