Molecular profiling of indoor microbial communities in moisture damaged and non-damaged buildings

Epidemiological studies have shown an elevation in the incidence of asthma, allergic symptoms and respiratory infections among people living or working in buildings with moisture and mould problems. Microbial growth is suspected to have a key role, since the severity of microbial contamination and symptoms show a positive correlation, while the removal of contaminated materials relieves the symptoms. However, the cause-and-effect relationship has not been well established and knowledge of the causative agents is incomplete. The present consensus of indoor microbes relies on culture-based methods. Microbial cultivation and identification is known to provide qualitatively and quantitatively biased results, which is suspected to be one of the reasons behind the often inconsistent findings between objectively measured microbiological attributes and health. In the present study the indoor microbial communities were assessed using culture-independent, DNA based methods. Fungal and bacterial diversity was determined by amplifying and sequencing the nucITS- and16S-gene regions, correspondingly. In addition, the cell equivalent numbers of 69 mould species or groups were determined by quantitative PCR (qPCR). The results from molecular analyses were compared with results obtained using traditional plate cultivation for fungi. Using DNA-based tools, the indoor microbial diversity was found to be consistently higher and taxonomically wider than viable diversity. The dominant sequence types of fungi, and also of bacteria were mainly affiliated with well-known microbial species. However, in each building they were accompanied by various rare, uncultivable and unknown species. In both moisture-damaged and undamaged buildings the dominant fungal sequence phylotypes were affiliated with the classes Dothideomycetes (mould-like filamentous ascomycetes); Agaricomycetes (mushroom- and polypore-like filamentous basidiomycetes); Urediniomycetes (rust-like basidiomycetes); Tremellomycetes and the family Malasseziales (both yeast-like basidiomycetes). The most probable source for the majority of fungal types was the outdoor environment. In contrast, the dominant bacterial phylotypes in both damaged and undamaged buildings were affiliated with human-associated members within the phyla Actinobacteria and Firmicutes. Indications of elevated fungal diversity within potentially moisture-damage-associated fungal groups were recorded in two of the damaged buildings, while one of the buildings was characterized by an abundance of members of the Penicillium chrysogenum and P. commune species complexes. However, due to the small sample number and strong normal variation firm conclusions concerning the effect of moisture damage on the species diversity could not be made. The fungal communities in dust samples showed seasonal variation, which reflected the seasonal fluctuation of outdoor fungi. Seasonal variation of bacterial communities was less clear but to some extent attributable to the outdoor sources as well. The comparison of methods showed that clone library sequencing was a feasible method for describing the total microbial diversity, indicated a moderate quantitative correlation between sequencing and qPCR results and confirmed that culture based methods give both a qualitative and quantitative underestimate of microbial diversity in the indoor environment. However, certain important indoor fungi such as Penicillium spp. were clearly underrepresented in the sequence material, probably due to their physiological and genetic properties. Species specific qPCR was a more efficient and sensitive method for detecting and quantitating individual species than sequencing, but in order to exploit the full advantage of the method in building investigations more information is needed about the microbial species growing on damaged materials. In the present study, a new method was also developed for enhanced screening of the marker gene clone libraries. The suitability of the screening method to different kinds of microbial environments including biowaste compost material and indoor settled dusts was evaluated. The usability was found to be restricted to environments that support the growth and subsequent dominance of a small number microbial species, such as compost material.

Kosteusvaurioiden aiheuttamalla huonolla sisäilmalla tiedetään olevan epidemiologinen yhteys mm. astman, allergisten oireiden ja hengitystieinfektioiden esiintyvyyteen. Mikrobikasvulla epäillään olevan tärkeä rooli ilmiön aiheuttajana, sillä havaitun home kasvun laajuuden ja oireiden vakavuuden välillä on positiivinen yhteys ja toisaalta homeisten materiaalien poisto vähentää oireita. Tämänhetkinen tieto oireita aiheuttavista tekijöistä ja oireiden syntymekanismeista on kuitenkin vajavaista. Sisäympäristöjen mikrobilajiston tuntemus perustuu suurelta osin viljelypohjaisilla menetelmillä saatuun tietoon. Viljelymenetelmien kuitenkin tiedetään antavan laadullisesti ja määrällisesti vääristyneen kuvan mikrobistosta, minkä epäillään olevan yhtenä syynä siihen, että sisäympäristöistä mitattujen mikrobistojen ja terveysongelmien välillä ei aina havaita johdonmukaisia yhteyksiä. Tässä työssä tutkittiin sisäympäristöjen mikrobistoja viljelystä riippumattomin, DNA-pohjaisin menetelmin. Sieni- ja bakteerilajiston kartoittamiseen käytettiin ribosomaalisten DNA-merkkijaksojen (ITS- ja 16S -geenialueet) monistusta ja sekvensointia. 69 homelajin solumäärät määritettiin lisäksi kvantitatiivisella PCR-menetelmällä (qPCR). Saatuja tuloksia verrattiin samoista näytteistä viljelymenetelmin saatuihin tuloksiin. Sisätilojen mikrobidiversiteetin havaittiin olevan DNA-pohjaisin menetelmin merkittävästi viljelymenetelmin todettua monimuotoisempaa ja lajirikkaampaa. Yleisimmät sekvenssityypit olivat peräisin tunnetuista lajeista mutta kaikista tutkituista rakennuksista löydettiin myös uudentyyppisiä DNA-merkkisekvenssejä, joista osa saattaa edustaa aiemmin tuntemattomia mikrobilajeja. Sekä kosteusvaurio- että verrokkirakennuksissa yleisimmät sienten sekvenssityypit vastasivat kaariin Ascomycetes ja Basidiomycetes (kanta- ja kotelosienet) kuuluvien luokkien Dothideomycetes, Agaricomycetes, Urediniomycetes ja Tremellomycetes, sekä heimon Malasseziales lajien DNA-sekvenssejä. Ko. ryhmiin lukeutuu home-, lakkisieni-, kääpä-, ruoste- ja hiivalajeja. Suurin osa sienilajistosta oli todennäköisimmin peräisin ulkoympäristöstä. Sitä vastoin bakteerisekvenssien enemmistö vastasi ihmisperäisten, pääjaksoihin Actinomycetes ja Firmicutes kuuluvien lajien merkkijaksoja. Mikrobiryhmien esiintymisessä kosteusvaurio- ja verrokkirakennuksissa havaittiin eroja; kahdessa tutkitusta vauriokohteesta havaittiin verrokkia korkeampaa diversiteettiä rakennusperäisiä lajeja sisältävissä sieniryhmissä, kun taas yhden vauriokohteen sekvenssiaineistossa havaittiin poikkeuksellisen runsaasti Penicillium chrysogenum- ja P. commune lajiryhmittymiin kuuluvia merkkijaksoja. Pienestä näytemäärästä ja lajiston voimakkaasta normaalivaihtelusta johtuen luotettavia johtopäätöksiä kosteusvaurioiden osuudesta lajiston vaihteluun ei kuitenkaan kyetty tekemään. Sienilajistosta kuvattiin vuodenaikaisvaihtelua, joka vastaa lajiston vaihtelua ulkoympäristössä. Bakteerilajiston vuodenaikaisvaihtelu ei ollut yhtä selkeää, mutta eräiden ryhmien osalta vaihtelu oli yhdistettävissä ulkoympäristön bakteerikulkeuman vaihteluun. Menetelmien vertailu osoitti sekvensoinnin toimivuuden kokonaislajiston kuvauksessa, osoitti kohtuullisen kvantitatiivisen korrelaation sekvensoinnin ja qPCR:n antamien tulosten välillä ja vahvisti aiemmat havainnot siitä, että viljelymenetelmä antaa sekä määrällisen että laadullisen aliarvion lajistosta. Toisaalta eräiden merkittävien sisäilmahomeiden kuten Penicillium:in ja sen sukulaisten todettiin olevan aliedustettuja sekvenssiaineistoissa, todennäköisesti lajien fysiologisista ja geneettisistä ominaisuuksista johtuen. Lajispesifisen qPCR:n katsottiin olevan herkkä ja tehokas menetelmä lajiston määrälliseen tutkimiseen, mutta menetelmän hyödyntämiseksi tarvitaan kattavampaa tietoa kosteusvauriomateriaaleilla esiintyvistä mikrobeista. Työssä kehitettiin lisäksi menetelmä mikrobilajistojen sekvensointipohjaisessa kartoittamisessa tarvittavien kloonikirjastojen käsittelyn tehostamiseksi, sekä arvioitiin menetelmän toimivuutta komposti- ja huonepölynäytteillä. Menetelmän hyödynnettävyyden todettiin rajoittuvan ympäristöihin joissa olosuhteet suosivat harvojen mikrobilajien voimakasta lisääntymistä ja joissa siten on selkeästi dominoitu mikrobiyhteisörakenne, esimerkkinä kehittynyt kompostimassa.