Molecular studies on LIM-domain protein CRP1

Various intrinsic and external factors are constantly attacking the cells causing damage to DNA and to other cellular structures. Cells in turn have evolved with different kinds of mechanisms to protect against the attacks and to repair the damage. Ultraviolet radiation (UVR) is one of the major environmental genotoxic carcinogens that causes inflammation, mutations, immunosuppression, accelerated aging of the skin and skin cancers. Epidermis is the outermost layer of the skin consisting mostly of keratinocytes, whose primary function is to protect the skin against e.g. UV radiation. LIM domain proteins are a group of proteins involved in regulation of cell growth, damage signalling, cell fate determination and signal transduction. Despite their two zinc fingers, LIM domains do not bind to DNA, but rather mediate protein-protein interactions and function as modular protein binding interfaces. We initially identified CSRP1 as UVR-regulated transcript by using expression profiling. Here we have further studied the regulation and function of CRP1, a representative of cysteine rich protein- family consisting of two LIM domains. We find that CRP1 is increased by UVR in primary human keratinocytes and in normal human skin fibroblasts. Ectopic expression of CRP1 protected the cells against UVR and provided a survival advantage, whereas silencing of CRP1 rendered the cells more photosensitive. Actinic keratosis is a premalignant lesion of skin caused by excess exposure to sunlight and sunburn, which may lead to formation of squamous cell carcinoma. The expression of CRP1 was increased in basal keratinocytes of Actinic keratosis patient specimens suggesting that CRP1 may be increased by constant exposure to UVR and may provide survival advantage for the cells also in vivo. In squamous cell carcinoma, CRP1 was only expressed in the fibroblasts surrounding the tumour. Moreover, we found that ectopic expression of CRP1 suppresses cell proliferation. Transforming growth factor beta (TGFbeta) is a multifunctional cytokine that regulates several functions in cell including growth, apoptosis and differentiation, and plays important roles in pathological disorders like cancer and fibrosis. We found that TGFbeta-signalling pathway regulates CRP1 at protein, but not at transcriptional level. The increase was mediated both through Smad and non-Smad signalling pathways involving MAPK/p38. Furthermore, we found that TGFbeta-mediated increase in CRP1 was associated with myofibroblast differentiation, and that CRP1 was significantly more expressed in idiopathic pulmonary fibrosis as compared to normal lung specimens. Since cell contractility is a distinct feature of myofibroblasts, and CRP1 is associated with actin cytoskeleton, we studied the role of CRP1 in cell contractility. CRP1 was found to localize to stress fibres that mediate contractility and to mediate myofibroblast contraction. These studies identify CRP1 as a stress responsive and cytokine regulated cytoskeletal protein that participates in pathological processes involved in fibrotic diseases and cancer.

Solu ja sen DNA ovat jatkuvasti alttiina vaurioittaville tekijöille, ja solu on kehittänyt erilaisia tapoja puolustautuakseen niitä vastaan. Ultraviolettisäteily on yksi ympäristön yleisimmistä karsinogeeneistä, joka aiheuttaa mutaatioita, ihon nopeutunutta ikääntymistä ja ihosyöpiä. Orvaskesi on ihon uloin osa, joka koostuu pääosin keratinosyyteistä, ja niiden tehtävänä on suojata ihoa mm. ultraviolettisäteilyä vastaan. LIM-proteiinit toimivat useissa eri tehtävissä solussa, ja ovat osallisena mm. solun kasvussa, vauriosignaloinnissa, stressivasteessa ja signaalinvälityksessä. Vaikka näitä proteiineja yhdistääkin sinkkisormi -rakenne, ne eivät kykene sitoutumaan DNA:han, vaan toimivat proteiini-proteiini-interaktioiden kautta. Tutkimamme LIM-proteiini, CRP1, tuli alunperin esiin geenisirututkimuksessamme, jonka tarkoituksena oli etsiä aiemmin tuntemattomia ultraviolettisäteilyn säätelemiä geenejä. Tutkimuksissamme tuli esiin, että ultraviolettisäteily lisäsi CRP1-proteiinin määrää. CRP1:n ylituottaminen soluissa tarjosi soluille suojan säteilyä ja solukuolemaa vastaan, kun taas CRP1:n hiljentäminen johti lisääntyneeseen ultraviolettisäteilyn aiheuttamaan solukuolemaan. Koska ihon keratinosyytit ovat ensisijainen kohde ultraviolettisäteilyn aiheuttamille vaurioille, tutkimme CRP1:n ilmentymistä ihmisen primaareissa keratinosyyteissä ja huomasimme, että ultraviolettisäteily nostaa CRP1:n määrää myös niissä. Aktiininen keratoosi on auringon aiheuttama ihosairaus, joka voi johtaa ihon okasolusyövän syntyyn. Tutkimme CRP1:n ilmentymistä potilaista eristetyistä näytteistä, ja huomasimme CRP1-proteiinin tasojen nousseen aktiinisessa keratoosissa keratinosyyteissä, mikä saattaa olla merkkinä siitä, että CRP1-proteiinin määrä nousee ultraviolettisäteilyn myötä ja tarjoaa soluille selviytymisedun solukuolemaa vastaan myös kudoksissa. Okasolusyöpänäytteissä CRP1 ilmentyi lähinnä kasvainta ympäröivissä fibroblasteissa. Transformoiva kasvutekijä beta (TGFbeta) säätelee kasvua, apoptoosia ja erilaistumista, ja vaikuttaa fibroosin ja syövän kehittymiseen. Tutkimuksissamme kävi ilmi, että TGFbeta säätelee CRP1:n ilmentymistä soluissa, ja tämä säätely liittyi myofibroblastien erilaistumiseen. Koska myofibroblasteilla on erityisesti merkitystä fibroottisissa taudeissa, tutkimme CRP1:n ilmentymistä idiopaattisessa keuhkofibroosissa. CRP1:n määrä oli merkittävästi kohonnut IPF-potilaiden keuhkoista eristetyissä näytteissä. Lisäksi myofibroblastien supistumiskyvyllä on taudin kannalta merkittävä osuus, ja tutkimuksemme osoittavat CRP1:n vaikuttavan solun supistumiskykyyn. Kokonaisuutena tutkimuksemme on tuonut tietoa miten CRP1 proteiini toimii solujen vaurio- ja stressivasteissa.