Generation of Flat and Curved Membranes by Inverse-BAR Domain Proteins

Biological membranes are tightly linked to the evolution of life, because they provide a way to concentrate molecules into partially closed compartments. The dynamic shaping of cellular membranes is essential for many physiological processes, including cell morphogenesis, motility, cytokinesis, endocytosis, and secretion. It is therefore essential to understand the structure of the membrane and recognize the players that directly sculpt the membrane and enable it to adopt different shapes. The actin cytoskeleton provides the force to push eukaryotic plasma membrane in order to form different protrusions or/and invaginations. It has now became evident that actin directly co-operates with many membrane sculptors, including BAR domain proteins, in these important events. However, the molecular mechanisms behind BAR domain function and the differences between the members of this large protein family remain largely unresolved. In this thesis, the structure and functions of the I-BAR domain family members IRSp53 and MIM were thoroughly analyzed. By using several methods such as electron microscopy and systematic mutagenesis, we showed that these I-BAR domain proteins bind to PI(4,5)P2-rich membranes, generate negative membrane curvature and are involved in the formation of plasma membrane protrusions in cells e.g. filopodia. Importantly, we characterized a novel member of the BAR-domain superfamily which we named Pinkbar. We revealed that Pinkbar is specifically expressed in kidney and epithelial cells, and it localizes to Rab13-positive vesicles in intestinal epithelial cells. Remarkably, we learned that the I-BAR domain of Pinkbar does not generate membrane curvature but instead stabilizes planar membranes. Based on structural, mutagenesis and biochemical work we present a model for the mechanism of the novel membrane deforming activity of Pinkbar. Collectively, this work describes the mechanism by which I-BAR domain proteins deform membranes and provides new information about the biological roles of these proteins. Intriguingly, this work also gives evidence that significant functional plasticity exists within the I-BAR domain family. I-BAR proteins can either generate negative membrane curvature or stabilize planar membrane sheets, depending on the specific structural properties of their I-BAR domains. The results presented in this thesis expand our knowledge on membrane sculpting mechanisms and shows for the first time how flat membranes can be generated in cells.

Biologiset kalvot ympäröivät kaikkia soluja sekä mahdollistavat molekyylien eristämisen erillisiin osastoihin solun sisällä. Solukalvojen jatkuva ja hallittu muotoilu on välttämätöntä monien tärkeiden fysiologisten toimintojen varmistamiseksi. Solun jakautuminen, liikkuminen sekä ravintoaineiden ja solun pintareseptorien sisäänotto ovat kaikki esimerkkejä tapahtumista, jotka edellyttävät solukalvon muokkaamista. Tämän vuoksi on erittäin tärkeää ymmärtää solukalvojen rakennetta ja tunnistaa kaikki ne tekijät, jotka mahdollistavat tämän kalvojen muotojen sinfonian. Solu käyttää aktiinitukirangan synnyttämää voimaa liikuttaakseen solukalvoa eteenpäin muodostaen ulokkeita. Vaihtoehtoisesti solukalvon liike voi suuntautua kohti solun keskustaa, mikä mahdollistaa materiaalin sisäänoton. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että aktiini toimii yhdessä useiden solukalvoja muokkaavien proteiinien kanssa näissä tärkeissä tapahtumissa. Suurin kalvoja muokkaava proteiiniperhe on BAR-domeenin sisältävät proteiinit. Vaikka BAR-proteiineja on tutkittu paljon, niiden toiminnan mahdollistavia molekyylimekanismeja ei vielä juurikaan tunneta. Tämän väitöskirjan osatavoitteena oli analysoida I-BAR-proteiiniperheen jäsenten IRSp53:n ja MIM:n rakennetta ja toimintamalleja. Käyttämällä useita toisiaan tukevia menetelmiä (esim. elektronimikroskopia ja systemaattinen mutageneesi) pystyimme osoittamaan, että I-BAR-proteiinit sitovat PI(4,5)P2-lipidejä sisältäviä kalvoja, taivuttavat kalvoja negatiiviseen suuntaan ja ovat osallisena solukalvon sormimaisten ulokkeiden muodostuksessa. Väitöskirjani tärkein saavutus on uuden BAR-proteiinin Pinkbar:in biokemiallisten, rakenteellisten sekä fysiologisten ominaisuuksien kuvaaminen. Väitöskirjassa osoitetaan, että Pinkbar-proteiinia esiintyy merkittävästi munuaisen ja suoliston pintasolukossa (enterosyyteissä). Enterosyyteissä Pinkbar esiintyy usein yhdessä Rab13-proteiinia sisältävien vesikkeleiden kanssa. Poiketen muista tutkimistamme I-BAR-proteiineista, Pinkbar ei taivuta kalvoja vaan tukee niitä suorien rakenteiden muodostuksessa. Tässä väitöskirjassa esitän mallin siitä, miten oletamme Pinkbar-proteiinin muokkaavan solukalvoja. Tämä väitöskirjatyö kuvaa niitä mekanismeja joita I-BAR-proteiinit käyttävät muokatessaan solukalvoja, sekä antaa uutta tietoa näiden proteiinien biologisista tehtävistä. Lisäksi tämä työ esittää todisteita siitä, että I-BAR-proteiiniperheen sisällä on toiminnallisia ja rakenteellisia eroja. Tässä väitöskirjassa esitetyt tulokset laajentavat aiempaa käsitystämme solukalvojen muokkausmekanismeista, sekä esittävät ensimmäistä kertaa miten proteiini voi tukea suoria solukalvoja.