Molecular genetics of Usher syndrome -inherited deafness and blindness

Usher syndrome (USH) is an inherited blindness and deafness disorder with variable vestibular dysfunction. The syndrome is divided into three subtypes according to the progression and severity of clinical symptoms. The gene mutated in Usher syndrome type 3 (USH3), clarin 1 (CLRN1), was identified in Finland in 2001 and two mutations were identified in Finnish patients at that time. Prior to this thesis study, the two CLRN1 gene mutations were the only USH mutations identified in Finnish USH patients. To further clarify the Finnish USH mutation spectrum, all nine USH genes were studied. Seven mutations were identified: one was a previously known mutation in CLRN1, four were novel mutations in myosin VIIa (MYO7A) and two were a novel and a previously known mutation in usherin (USH2A). Another aim of this thesis research was to further study the structure and function of the CLRN1 gene, and to clarify the effects of mutations on protein function. The search for new splice variants resulted in the identification of eight novel splice variants in addition to the three splice variants that were already known prior to this study. Studies of the possible promoter regions for these splice variants showed the most active region included the 1000 bases upstream of the translation start site in the first exon of the main three exon splice variant. The 232 aa CLRN1 protein encoded by the main (three-exon) splice variant was transported to the plasma membrane when expressed in cultured cells. Western blot studies suggested that CLRN1 forms dimers and multimers. The CLRN1 mutant proteins studied were retained in the endoplasmic reticulum (ER) and some of the USH3 mutations caused CLRN1 to be unstable. During this study, two novel CLRN1 sequence alterations were identified and their pathogenicity was studied with cell culture protein expression. Previous studies with mice had shown that Clrn1 is expressed in mouse cochlear hair cells and spiral ganglion cells, but the expression profile in mouse retina remained unknown. The Clrn1 knockout mice display cochlear cell disruption/death, but do not have a retinal phenotype. The zebrafish, Danio rerio, clrn1 was found to be expressed in hair cells associated with hearing and balance. Clrn1 expression was also found in the inner nuclear layer (INL), photoreceptor layer and retinal pigment epithelium layer (RPE) of the zebrafish retina. When Clrn1 production was knocked down with injected morpholino oligonucleotides (MO) targeting Clrn1 translation or correct splicing, the zebrafish larvae showed symptoms similar to USH3 patients. These larvae had balance/hearing problems and reduced response to visual stimuli. The knowledge this thesis research has provided about the mutations in USH genes and the Finnish USH mutation spectrum are important in USH patient diagnostics. The extended information about the structure and function of CLRN1 is a step further in exploring USH3 pathogenesis caused by mutated CLRN1 as well as a step in finding a cure for the disease.

Usherin oireyhtymään (USH) kuuluu perinnöllinen kuuro-sokeus ja vaihteleva tasapainon häiriö. Oireyhtymä jaetaan kolmeen alatyyppiin kliinisten oireiden etenemisen ja vaikeusasteen mukaan. Oireyhtymän alatyyppi 3 (USH3) tunnistettiin alkujaan suomalaisissa potilaissa. Geeni, klariini, jonka mutatoituminen aiheuttaa USH3:n löydettiin Suomessa vuonna 2001 ja klariinista löytyi kaksi mutaatiota. Näistä toinen on suomalainen päämutaatio ja löytyy jokaiselta suomalaiselta USH3 potilaalta. Usherin oireyhtymän eri alatyyppejä aiheuttavat kuitenkin mutaatiot yhdeksässä geenissä, joiden tuottamien proteiinien uskotaan toimivan yhdessä niin silmän kuin korvan soluissa. Tämän väitöskirjan tekemisen aikana suomalaisilta potilailta löytyivät ensimmäiset USH1 ja USH2 geenien mutaatiot. Näistä neljä USH1 mutaatiota sekä yksi USH2 mutaatio on aikaisemmin tuntemattomia ja vain yksi Suomesta tunnistettu USH2 mutaatio on jo aikaisemmin raportoitu muualla. Suomalaisten USH -mutaatioiden kirjo onkin tyypillinen Suomen väestölle. Mutaatioiden kartoitus on tärkeää potilaiden diagnostiikassa koska mutatoituneen geenin tietäminen helpottaa mm. potilaiden taudin etenemisen ennusteessa ja hoitotoimenpiteiden päättämisessä. Tutkimus keskittyi klariini -geeniin ja sen geenivirheiden aiheuttamaan, suomalaiseen tautiperimään kuuluvaan USH3 alatyyppiin. Tutkimuksen aikana klariinista löydettiin kahdeksan uutta silmukointimuotoa. Tällöin geenin osat yhdistellään versioiksi, jotka mahdollisesti luetaan erilaisiksi proteiineiksi. Klariinin toiminnan säätelystä vastaava alue pystyttiin kartoittamaan ja sen toimintaa tutkimaan eri solutyypeissä. Lisäksi klariini -proteiinia tutkimalla nähtiin proteiinin kulkeutuvan solukalvolle ja mutatoituneiden proteiinien huomattiin jäävän solun sisäisiin kalvostoihin. Mutatoituessaan klariini muuttuu lisäksi usein epävakaaksi. Tiedämme, että klariini on kalvoproteiini ja klariinit muodostavat keskenään rykelmiä kalvoilla. Emme kuitenkaan tiedä mikä tehtävä klariinin mutatoituessa häiriintyy. Tiedämme vain sen että tuo tehtävä on elintärkeä verkkokalvolla että sisäkorvassa. Klariinia tutkittiin myös silmässä ja korvassa, joissa USH oireet esiintyvät. Hiirillä, joilla ei ole toimivaa klariinia, klariinin puutos aiheuttaa pelkkää kuuroutta muttei sokeutta. Seeprakaloissa klariinia tuotetaan korvan karvasoluissa sekä verkkokalvolla. Kun klariinin tuotto estetään seeprakalan kehityksen aikana, niille kehittyy kuulon/tasapainoaistin häiriöitä ja kalojen näkökyky heikentyy. Tutkimus on kuitenkin vasta alussa. USH3 -kalamalli alkaa tuottaa toimivaa klariinia parin päivän ikäisenä. Osalla kaloista kyky nähdä ja kuulla alkaa palautua. Kysymys siitä, voiko jo alkaneen USH3 -oireyhtymän pysäyttää tai jopa parantaa tuomalla normaalin klariini -geenin verkkokalvolle tai sisäkorvaan, on yhäkin vastaamatta. Onko klariinin tehtävä tärkeä kehityksen aikana, vai voiko sen korvata myöhemmin, vaikka silmä ja korva ovat kehittyneet ilman klariinia, ovat tärkeitä kysymyksiä geeniterapian onnistumisen kannalta.