Microbiological characterisation of soils : Evaluation of some critical steps in data collection and experimental design

The study of soil microbiota and their activities is central to the understanding of many ecosystem processes such as decomposition and nutrient cycling. The collection of microbiological data from soils generally involves several sequential steps of sampling, pretreatment and laboratory measurements. The reliability of results is dependent on reliable methods in every step. The aim of this thesis was to critically evaluate some central methods and procedures used in soil microbiological studies in order to increase our understanding of the factors that affect the measurement results and to provide guidance and new approaches for the design of experiments. The thesis focuses on four major themes: 1) soil microbiological heterogeneity and sampling, 2) storage of soil samples, 3) DNA extraction from soil, and 4) quantification of specific microbial groups by the most-probable-number (MPN) procedure. Soil heterogeneity and sampling are discussed as a single theme because knowledge on spatial (horizontal and vertical) and temporal variation is crucial when designing sampling procedures. Comparison of adjacent forest, meadow and cropped field plots showed that land use has a strong impact on the degree of horizontal variation of soil enzyme activities and bacterial community structure. However, regardless of the land use, the variation of microbiological characteristics appeared not to have predictable spatial structure at 0.5-10 m. Temporal and soil depth-related patterns were studied in relation to plant growth in cropped soil. The results showed that most enzyme activities and microbial biomass have a clear decreasing trend in the top 40 cm soil profile and a temporal pattern during the growing season. A new procedure for sampling of soil microbiological characteristics based on stratified sampling and pre-characterisation of samples was developed. A practical example demonstrated the potential of the new procedure to reduce the analysis efforts involved in laborious microbiological measurements without loss of precision. The investigation of storage of soil samples revealed that freezing (-20 °C) of small sample aliquots retains the activity of hydrolytic enzymes and the structure of the bacterial community in different soil matrices relatively well whereas air-drying cannot be recommended as a storage method for soil microbiological properties due to large reductions in activity. Freezing below -70 °C was the preferred method of storage for samples with high organic matter content. Comparison of different direct DNA extraction methods showed that the cell lysis treatment has a strong impact on the molecular size of DNA obtained and on the bacterial community structure detected. An improved MPN method for the enumeration of soil naphthalene degraders was introduced as an alternative to more complex MPN protocols or the DNA-based quantification approach. The main advantage of the new method is the simple protocol and the possibility to analyse a large number of samples and replicates simultaneously.

Maaperän mikrobiologisten ominaisuuksien tutkiminen on keskeistä monien ekosysteemiprosessien kuten orgaanisen aineen hajoamisen ja ravinteiden kierron ymmärtämiseksi. Väitöskirjatyöni tavoitteena oli arvioida ja kehittää maamikrobiologisessa tutkimuksessa käytettävien keskeisten menetelmien ja menettelytapojen luotettavuutta. Tarkastelu keskittyi neljään teemaan: 1) maaperän heterogeenisyys ja näytteenotto, 2) näytteiden säilytys, 3) DNA:n eristys maasta sekä 4) mikrobien lukumäärän määrittäminen MPN (most probable number)-tekniikalla. Näytteenoton suunnittelussa on tärkeää ottaa huomioon maaperän ominaisuuksien paikasta riippuva (spatiaalinen) ja ajallinen vaihtelu. Maankäytön vaikutuksia spatiaaliseen vaihteluun tutkittiin vertaamalla entsyymiaktiivisuuksia ja bakteeriyhteisön rakennetta metsän, niityn ja pellon pintamaissa. Ajallista ja syvyydestä riippuvaa vaihtelua selvitettiin seuraamalla entsyymiaktiivisuuksia peltomaaprofiilissa (0-40 cm) yhden kasvukauden aikana. Tulokset osoittivat, että maankäyttö vaikuttaa mikrobiyhteisön rakenteeseen ja toimintaan voimakkaasti. Huomattavia eroja havaittiin sekä aktiivisuuksien ja biomassan tasossa että vaihtelun suuruudessa. Vaihtelu oli yleisesti alhaisinta peltomaassa, keskimääräistä niittymaassa ja metsän mineraalimaassa ja korkeinta metsän orgaanisessa kerroksessa. Sitä vastoin selvää vaakasuuntaista spatiaalirakennetta, jossa varianssi kasvaa etäisyyden kasvaessa, ei biologisille muuttujille yleensä havaittu tutkitussa mittakaavassa 0.5-10 m. Peltomaan syvyysprofiilissa entsyymiaktiivisuudet laskivat, kuten yleensä myös kasvukauden aikana. Kehitimme uuden näytteenottostrategian maaperän mikrobiologisille muuttujille. Menettely perustuu näytevarannon keräämiseen ja siitä esikarakterisoinnin perusteella tehtävään ositettuun otantaan. Esimerkin avulla havainnollistettiin, miten yksinkertaista orgaanisen aineen pitoisuusmittausta voidaan hyödyntää työläistä entsyymimittauksista koituvan työmäärän vähentämiseen tarkkuuden kärsimättä. Säilytyskokeen tulokset osoittivat, että 4 kuukauden pakastus (-20 °C) säilyttää entsyymiaktiivisuudet sekä DNA-analyysin avulla havaittavan bakteeriyhteisön rakenteen eri maamatriiseissa kohtuullisen hyvin, mutta ilmakuivaus laskee aktiivisuuksien tasoa niin paljon, ettei se sovi mikrobiologisten maaperänäytteiden säilytykseen. Pakastus alle -70 °C:ssa on orgaanisille maanäytteille suositeltavin säilytysmenetelmä. DNA-uuttomenetelmien vertailussa havaittiin, että eristysmenetelmä vaikuttaa huomattavasti paitsi DNA:n saantoon ja pilkkoutumiseen myös yhteisösormenjälkianalyysin perusteella havaittavaan bakteerikirjoon. Tietyn funktionaalisen mikrobiryhmän kokoa voidaan mitata mikrobien kasvatukseen sekä DNA:han perustuvilla menetelmillä. Kehitimme uuden MPN-tekniikkaan pohjautuvan menetelmän naftaleenia hajottavien mikrobien lukumäärän määrittämiseksi maanäytteistä. Uudessa menetelmässä naftaleeni lisätään kasvuliuokseen kaasufaasin kautta, mikä yksinkertaistaa menettelyä ja mahdollistaa lukuisten rinnakkaisnäytteiden analysoinnin.