Genomic alterations in Myeloproliferative Neoplasms and Myelodysplastic Syndromes

Myeloproliferative neoplasms (MPN) and myelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of clonal hematopoietic disorders whose etiology and molecular pathogenesis are poorly understood. During the past decade, enormous developments in microarray technology and bioinformatics methods have made it possible to mine novel molecular alterations in a large number of malignancies, including MPN and MDS, which has facilitated the detection of new prognostic, predictive and therapeutic biomarkers for disease stratification. By applying novel microarray techniques, we profiled copy number alterations and microRNA (miRNA) expression changes in bone marrow aspirate and blood samples. In addition, we set up and validated an miRNA expression test for bone marrow core biopsies in order to utilize the large archive material available in many laboratories. We also tested JAK2 mutation status and compare it with the in vitro growth pattern of hematologic progenitors cells. In the study focusing on 100 MPN cases, we detected a Janus kinase 2 (JAK2) mutation in 71 cases. We observed spontaneous erythroid colony growth in all mutation-positive cases in addition to nine mutation negative cases. Interestingly, seven JAK2V167F negative ET cases showed spontaneous megakaryocyte colony formation, one case of which also harbored a myeloproliferative leukemia virus oncogene (MPL) mutation. We studied copy number alterations in 35 MPN and 37 MDS cases by using oligonucleotide-based array comparative hybridization (array CGH). Only one essential thrombocythemia (ET) case presented copy number alterations in chromosomes 1q and 13q. In contrast, MDS cases were characterized by numerous novel cryptic chromosomal aberrations with the most common copy number losses at 5q21.3q33.1 and 7q22.1q33, while the most common copy number gain was trisomy 8. As for the study of the bone marrow core biopsy samples, we showed that even though these samples were embedded in paraffin and underwent decalcification, they were reliable sources of miRNA and suitable for array expression analysis. Further, when studying the miRNA expression profiles of the 19 MDS cases, we found that, compared to controls, two miRNAs (one human Epstein-Barr virus (miR-BART13) miRNA and one human (has-miR-671-5p) miRNA) were downregulated, whereas two other miRNAs (hsa-miR-720 and hsa-miR-21) were upregulated. However, we could find no correlation between copy number alterations and microRNA expression when integrating these two data. This thesis brings to light new information about genomic changes implicated in the development of MPN and MDS, and also underlines the power of applying genome-wide array screening techniques in neoplasias. Rapid advances in molecular techniques and the integration of different genomic data will enable the discovery of the biological contexts of many complex disorders, including myeloid neoplasias.

Myeloproliferatiiviset neoplasmat (MPN) ja myelodysplastiset oireyhtymät (MDS) kuuluvat pahanlaatuisiin veritauteihin, joiden etiologia ja molekyylipatologia on valtaosiltaan tuntematon. Viimeisen vuosikymmenen aikana ovat mikrosirutekniikat ja bioinformatiikan menetelmät kehittyneet valtavasti ja mahdollistaneet uusien molekulaaristen muutosten löytämisen lukuisten pahanlaatuisten sairauksien niin myös MPN:n ja MDS:n kohdalla. Uudet ennusteelliset ja terapeuttiset biomarkkerit ovat parantaneet näiden tautien diagnosointia ja hoitomuotoja. Tämän väitöskirjan yhtenä tavoitteena oli uusimpia mikrosirutekniikoita käyttäen profiloida geenien kopiomäärämuutoksia ja mikro-RNA:iden (miRNA) ekspression muutoksia sekä luuydinaspiraatti- että verinäytteistä. Toisena tavoitteena oli tutkia parafiiniin valetun luuydinbiopsianäytemateriaalin käyttökelpoisuutta tuorenäytteisiin verrattuna miRNA-mikrosirutekniikkaan perustuvissa tutkimuksissa. Diagnosoinnin yhteydessä luuydinbiopsianäytteet arkistoidaan rutiininomaisesti laboratorioihin, joten tätä parafiiniin valettua näytemateriaalia on suuria määriä helposti hyödynnettävissä erilaisiin tutkimustarkoituksiin. Sadan MPN-näytteen kohdalla tutkimme myös JAK2- (Janus kinaasi 2) geenimutaatioita ja vertasimme tulosta in vitro kantasoluviljelmissä tapahtuneeseen spontaaniin pesäkekasvuun. JAK2 mutaatio havaittiin 71/100 tapauksessa. Spontaania erytroidista pesäkekasvua todettiin kaikissa mutaatiopositiivisissa tapauksissa sekä lisäksi yhdeksässä mutaationegatiivisessa tapauksessa. Seitsemässä JAK2-mutaationegatiivisessa ET-näytteessä (essentiaalisessa trombosytemia-näytteessä) todettiin spontaania megakaryosyyttistä pesäkekasvua; yhdessä näistä havaittiin myös MPL-mutaatio (myeloproliferative leukemia virus oncogene mutation). Geenien kopiomäärämuutoksia tutkittiin 35 MPN- ja 37 MDS-näytteestä käyttämällä oligonukleotidipohjaista vertailevaa genomista hybridisaatiota (VGH:ta). Ainoastaan yhdessä ET-näytteessä havaittiin kopiomäärämuutoksia kromosomeissa 1q ja 13q. Sitä vastoin MDS-näytteissä havaittiin lukuisia kryptisiä kromosomaalisia muutoksia, joista yleisimmin esiintyviä olivat kopiomäärähäviämät kromosomialueilla 5q21.3q33.1 and 7q22.1q33, kun taas yleisimmin esiintyvä kopiomäärän lisääntyminen oli trisomia 8. MiRNA-sirumenetelmään perustuvassa tutkimuksessamme havaittiin, että kontrolliryhmän verrokkinäytteisiin verrattuna kaksi miRNA:ta (has-miR-671-5p miRNA ja Epstein Barrin viruksen miR-BART13) olivat aliekspressoituneita 19 MDS näytteessä, kun taas kaksi muuta miRNA:ta (hsa-miR-720 and hsa-miR-21) olivat yliekspressoituneita. Vertailtaessa miRNA-tutkimuksen tuloksia VGH-menetelmällä saatuihin kopiomäärämuutostuloksiin mitään riippuvuuksia ei havaittu. Mitä tulee luuydinbiopsiamateriaaliin, tutkimuksemme osoitti, että vaikka nämä näytteet olivat parafiiniin valettuja ja dekalsifioituja, ne olivat luotettavia miRNA:n lähteitä ja soveltuvat hyvin mikrosiruekspression tutkimukseen. Tämä väitöskirjatutkimuksen avulla saatiin uutta tietoa MPN:n ja MDS:n kehittymiseen vaikuttavista geneettisistä muutoksista sekä myös vahvistui genominlaajuisten mikrosirutekniikoiden voima tutkittaessa pahanlaatuisia sairauksia. Molekyyligeneettisten tutkimusmenetelmien voimakas kehittyminen sekä erilaisten bioinformatiikan menetelmien ja datojen integraatio mahdollistavat entistä paremmin monimutkaisten biologisten mekanismien selvittämisen monien pahanlaatuisten sairauksien, niin myös pahanlaatuisten veritautien, kohdalla.