Functional expression and subcellular localization of the Cl- cotransporters KCC2 and NKCC1 in rodent hippocampal and neocortical neurons

The work presented here has focused on the role of cation-chloride cotransporters (CCCs) in (1) the regulation of intracellular chloride concentration within postsynaptic neurons and (2) on the consequent effects on the actions of the neurotransmitter gamma-aminobutyric acid (GABA) mediated by GABAA receptors (GABAARs) during development and in pathophysiological conditions such as epilepsy. In addition, (3) we found that a member of the CCC family, the K-Cl cotransporter isoform 2 (KCC2), has a structural role in the development of dendritic spines during the differentiation of pyramidal neurons. Despite the large number of publications dedicated to regulation of intracellular Cl-, our understanding of the underlying mechanisms is not complete. Experiments on GABA actions under resting steady-state have shown that the effect of GABA shifts from depolarizing to hyperpolarizing during maturation of cortical neurons. However, it remains unclear, whether conclusions from these steady-state measurements can be extrapolated to the highly dynamic situation within an intact and active neuronal network. Indeed, GABAergic signaling in active neuronal networks results in a continuous Cl- load, which must be constantly removed by efficient Cl- extrusion mechanisms. Therefore, it seems plausible to suggest that key parameters are the efficacy and subcellular distribution of Cl- transporters rather than the polarity of steady-state GABA actions. A further related question is: what are the mechanisms of Cl- regulation and homeostasis during pathophysiological conditions such as epilepsy in adults and neonates? Here I present results that were obtained by means of a newly developed method of measurements of the efficacy of a K-Cl cotransport. In Study I, the developmental profile of KCC2 functionality during development was analyzed both in dissociated neuronal cultures and in acute hippocampal slices. A novel method of photolysis of caged GABA in combination with Cl- loading to the somata was used in this study to assess the extrusion efficacy of KCC2. We demonstrated that these two preparations exhibit a different temporal profile of functional KCC2 upregulation. In Study II, we reported an observation of highly distorted dendritic spines in neurons cultured from KCC2-/- embryos. During their development in the culture dish, KCC2-lacking neurons failed to develop mature, mushroom-shaped dendritic spines but instead maintained an immature phenotype of long, branching and extremely motile protrusions. It was shown that the role of KCC2 in spine maturation is not based on its transport activity, but is mediated by interactions with cytoskeletal proteins. Another important player in Cl- regulation, NKCC1 and its role in the induction and maintenance of native Cl- gradients between the axon initial segment (AIS) and soma was the subject of Study III. There we demonstrated that this transporter mediates accumulation of Cl- in the axon initial segment of neocortical and hippocampal principal neurons. The results suggest that the reversal potential of the GABAA response triggered by distinct populations of interneurons show large subcellular variations. Finally, a novel mechanism of fast post-translational upregulation of the membrane-inserted, functionally active KCC2 pool during in-vivo neonatal seizures and epileptiform-like activity in vitro was identified and characterized in Study IV. The seizure-induced KCC2 upregulation may act as an intrinsic antiepileptogenic mechanism.

Gamma-aminovoihappo (GABA) on tärkein ehkäisevä välittäjäaine nisäkkäiden aivoissa. GABA:n vaikutukset perustuvat kloridia läpäisevien kanavien avautumiseen, ja solunsisäinen kloridipitoisuus vaikuttaa siten kanavien kautta kulkevan sähkövirran suuntaan eli polariteettiin.Vaikka solunsisäisen kloridipitoisuuden säätelyä on tutkittu sadoissa julkaisuissa, sen taustalla olevia mekanismeja ei tunneta vielä täysin. Kokeet soluviljelmillä ja aivoileikkeillä osoittivat jo kauan sitten että GABA:n vaikutus kortikaalisten hermosolujen solukalvoon muuttuu depolarisoivasta hyperpolarisoivaksi aivojen maturoituessa. On kuitenkin kyseenalaista, voidaanko näitä tuloksia suoraan yleistää ehjän ja aktiivisen hermoverkon dynaamiseen toimintaan. Aktiivisissa hermoverkoissa GABA-välitteinen signalointi aiheuttaa jatkuvaa kloridin kerääntymistä. Siksi kloriditransportterien ajalliset ja paikalliset tehokkuuden muutokset ovat fysiologisesti tärkeämpiä tekijöitä kuin GABA-vaikutuksen polaariteetti lepäävässä hermosolussa. Väitöskirjani ensimmäisessä kokeellisessa työssä KCC2-kotransportterin funktionaalisuuden kehitysprofiilia analysoitiin hermosoluviljelmissä ja hippokampusleikkeissä. Osoitimme, että näissä kähdessa preparaatissa KCC2:n ilmentymisen ajallinen profiili on erilainen, mikä johtunee tiettyjen ns. troofisten tekijöiden puutteesta viljemissä. Toisessa tutkimuksessa havaitsimme että dendriittiset okaset (jotka ovat keskeisiä rakenteita ärsyttäviä signaaleja välittävissä synapseissa) eivät kehity hermosoluissa joilta puuttu KCC2:ta koodaava geeni. Osoitimme, että KCC2:lla on keskeinen rakenteellinen rooli dendriittisten okasten kypsymisessä. Tämä siis ei perustu KCC2-molekyylin kuljettajatoimintaan vaan KCC2:n vuorovaikutuksiin solun tukirankaan liittyvien proteiinien kanssa. Kolmannen tutkimuksen kohteena oli NKCC1, joka on toinen tärkeä kuljettajamolekyyli kloridin säätelyssä. Osoitimme että NKCC1 pitää yllä kloridigradienttia hermosolujen aksonin initiaalisegmentin (AIS) ja soluosan välillä. Nämä kokeet tehtiin neokorteksin ja hippokampuksen neuroneilla aivoleikkeissä. Näiden tulosten perusteella voi olettaa että GABA:n vaikutuksia säätelee hermosolun eri osissa ehkäisevien synapsien läheisyydessä toimivien KCC2- ja NKCC1-molekyylien jakauma. GABA saattaa jopa toimia ärsyttävänä välittäjäaineena AIS:ssa. Neljännessä tutkimuksessa käsiteltiin uutta mekanismia jolla KCC2-molekyylin toiminta aktivoituu. Havaitsimme että epileptinen hermoverkkotoiminta immatuureissa aivoissa johtaa nopeaan KCC2-molekyylien insertioon hermosolukalvoihin. Tällainen epileptisten kohtausten aiheuttama KCC2:n säätely saattaa toimia hermosoluja suojelevana mekanismina.