Integration of miRNA and mRNA expression with DNA copy number of Ewing sarcoma cell lines

Ewing sarcoma is an aggressive and poorly differentiated malignancy of bone and soft tissue. It primarily affects children, adolescents, and young adults, with a slight male predominance. It is characterized by a translocation between chromosomes 11 and 22 resulting in the EWSR1-FLI1fusion transcription factor. The aim of this study is to identify putative Ewing sarcoma target genes through an integrative analysis of three microarray data sets. Array comparative genomic hybridization is used to measure changes in DNA copy number, and analyzed to detect common chromosomal aberrations. mRNA and miRNA microarrays are used to measure expression of protein-coding and miRNA genes, and these results integrated with the copy number data. Chromosomal aberrations typically contain also bystanders in addition to the driving tumor suppressor and oncogenes, and integration with expression helps to identify the true targets. Correlation between expression of miRNAs and their predicted target mRNAs is also evaluated to assess the results of post-transcriptional miRNA regulation on mRNA levels. The highest frequencies of copy number gains were identified in chromosome 8, 1q, and X. Losses were most frequent in 9p21.3, which also showed an enrichment of copy number breakpoints relative to the rest of the genome. Copy number losses in 9p21.3 were found have a statistically significant effect on the expression of MTAP, but not on CDKN2A, which is a known tumor-suppressor in the same locus. MTAP was also down-regulated in the Ewing sarcoma cell lines compared to mesenchymal stem cells. Genes exhibiting elevated expression in association with copy number gains and up-regulation compared to the reference samples included DCAF7, ENO2, MTCP1, andSTK40. Differentially expressed miRNAs were detected by comparing Ewing sarcoma cell lines against mesenchymal stem cells. 21 up-regulated and 32 down-regulated miRNAs were identified, includingmiR-145, which has been previously linked to Ewing sarcoma. The EWSR1-FLI1 fusion gene represses miR-145, which in turn targets FLI1 forming a mutually repressive feedback loop. In addition higher expression linked to copy number gains and compared to mesenchymal stem cells, STK40 was also found to be a target of four different miRNAs that were all down-regulated in Ewing sarcoma cell lines compared to the reference samples. SLCO5A1 was identified as the only up-regulated gene within a frequently gained region in chromosome 8. This region was gained in over 90 % of the cell lines, and also with a higher frequency than the neighboring regions. In addition, SLCO5A1 was found to be a target of three miRNAs that were down-regulated compared to the mesenchymal stem cells.

Ewingin sarkooma on aggressiivinen ja erilaistumaton luu- ja pehmytkudossyöpä. Se vaivaa pääasiassa lapsia, nuoria ja nuoria aikuisia, ja on hieman yleisempi miehillä. Sen tunnusmerkki on kromosomien11 ja 22 välillä tapahtuva uudelleenjärjestäytyminen, jonka tuloksena on EWSR1-FLI1fuusiogeenin tuottama transkriptiofaktori. Tämän tutkielman tarkotuksena on tunnistaa Ewingin sarkoomalle tärkeitä kohdegeeniehdokkaita käyttäen kolmea erityyppistä mikrosiruaineistoa. Array comparative genomic hybridization -teknologialla mitataan DNA:n kopiolukua, ja sen analysointi mahdollistaa yleisten kromosomipoikkeavuuksien tunnistamisen. mRNA- and miRNA-siruja käytetään proteiineja tuottavienja miRNA-geenien ilmentymisen mittaamiseen, ja niiden tulokset yhdistetään kopiolukuaineistoon. Kromosomipoikkavuudet tyypillisesti sisältävät myös sivullisia geenejä varsinaisten syöpä- ja kasvurajoitegeenienlisäksi, ja yhdistäminen ilmentymisaineistoon mahdollistaa varsinaisten kohdegeenien tunnistamisen. Myös miRNA:iden ja niiden ennustettujen kohde-mRNA:iden välinen korrelaatio mitataan määrittämään transkription jälkeisen säätelyn vaikutusta mRNA:iden tasoille. Yleisimmät kopiolukumonistumat tunnistettiin kromosomeista 8, 1q ja X. Häviämät olivat yleisimpiä raidassa 9p21.3, jonka kohdalla havaitiin myös katkoskohtien rikastuma muuhun genomiinverrattuna. Kopiolukumuutoksilla 9p21.3:ssa havaittiin olevan tilastollisesti merkitsevä vaikutus MTAP:n ilmentymiseen, mutta ei CDKN2A:n, joka on tunnettu kasvurajoitegeeni samassa kohtaa genomia. MTAP:n ilmentyminen oli myös alhaisempaa Ewing sarkooma -solulinjoissa kuin mesenkymaalisissa kantasoluissa. Kohonnutta ilmentymistä kopiolukumuutoksista johtuen ja verrokkinäytteensuhteen havaitiin geeneissä DCAF7, ENO2, MTCP1 ja STK40. miRNA-geenien ilmentymistä verrattiin Ewingin sarkooma -solulinjojen ja mesenkymaalisten kantasolujenvälillä. 21:n miRNA:n ilmentymisen havaittiin olevan koholla ja 32:n alhaisempi kuin vertailunäytteissä. Alhaisempi ilmentyminen havaitiin myös miR-145:n kohdalla, kuten on aikaisemminkin havaittu Ewingin sarkooman kohdalla. Fuusiogeeni EWSR1-FLI1 vaimentaa miR-145:n ilmentymistä, jonka yksi kohdegeeni taas on FLI1, synnyttäen näin vastavuoroisesti vaimentavan palautesilmukan. Sen lisäksi että STK40:n ilmentyminen oli Ewing sarkooma -solulinjoissa koholla mesenkymaalisiin kantasoluihin nähden, ja että monistumien havaittiin nostaneen STK40:n ilmentymistä, sen havaittiin myös olevan kohdegeeni neljälle miRNA:lle, joiden ilmentyminen oli alentunut. SLCO5A1:n havaittiin olevan ainoa koholla oleva geeni usein monistuneella alueella kromosomissa 8. Alue oli monistunut yli 90 %:ssa solulinjoista, yleisyyden myös ollessa vierekkäisiä alueita korkeampi. Tämän lisäksi SLCO5A1 on kohdegeeni kolmelle miRNA:lle, joiden ilmentyminen oli alentunut mesenkymaalisiin kantasoluin verrattuna.