Mechanisms of azole resistance and carcinogenic acetaldehyde production in chronic mucosal candidosis

Autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED, APS1) is an autoimmune disease caused by a loss-of function mutation in the autoregulator gene (AIRE). Patients with APECED suffer from chronic mucocutaneous candidosis (CMC) of the oral cavity and oesophagus often since early childhood. The patients are mainly colonized with Candida albicans and decades of exposure to antifungal agents have lead to the development of clinical and microbiological resistance in the treatment of CMC in the APECED patient population in Finland. A high incidence of oral squamous cell carcinoma is associated with oral CMC lesions in the APECED patients over the age of 25. The overall aim of this study was firstly, to investigate the effect of long-term azole exposure on the metabolism of oral C. albicans isolates from APECED patients with CMC and secondly, to analyse the specific molecular mechanisms that are responsible for these changes. The aim of the first study was to examine C. albicans strains from APECED patients and the level of cross-resistance to miconazole, the recommended topical compound for the treatment of oral candidosis. A total of 16% of the strains had decreased susceptibility to miconazole and all of these isolates had decreased susceptibility to fluconazole. Miconazole MICs also correlated with MICs to voriconazole and posaconazole. A significant positive correlation between the years of miconazole exposure and the MICs to azole antifungal agents was also found. These included azoles the patients had not been exposed to. The aim of our second study was to determine if the APECED patients are continuously colonized with the same C. albicans strains despite extensive antifungal treatment and to gain a deeper insight into the genetic changes leading to azole resistance. The strains were typed using MLST and our results confirmed that all patients were persistently colonized with the same or a genetically related strain despite antifungal treatment between isolations. No epidemic strains were found. mRNA expression was analysed by Northern blotting, protein level by western blotting, and TAC1 and ERG11 genes were sequenced. The main molecular mechanisms resulting in azole resistance were gain-of-function mutations in TAC1 leading to over expression of CDR1 and CDR2, genes linked to azole resistance. Several strains had also developed point mutations in ERG11, another gene linked to azole resistance. In the third study we used gas chromatography to test whether the level of carcinogenic acetaldehyde produced by C. albicans strains isolated from APECED patients were different from the levels produced by strains isolated from healthy controls and oral carcinoma patients. Acetaldehyde is a carcinogenic product of alcohol fermentation and metabolism in microbes associated with cancers of the upper digestive tract. In yeast, acetaldehyde is a by-product of the pyruvate bypass that converts pyruvate into acetyl-CoA during fermentation. Our results showed that strains isolated from APECED patients produced mutagenic levels of acetaldehyde in the presence of glucose (100mM, 18g/l) and the levels produced were significantly higher than those from strains isolated from controls and oral carcinoma patients. All strains in the study, however, were found to produce mutagenic levels of acetaldehyde in the presence of ethanol (11mM). The glucose and ethanol levels used in this study are equivalent to those found in food and beverages and our results highlight the role of dietary sugars and ethanol on carcinogenesis. The aims of our fourth study were to research the effect of growth conditions in the levels of acetaldehyde produced by C. albicans and to gain deeper insight into the role of different genes in the pyruvate-bypass in the production of high acetaldehyde levels. Acetaldehyde production in the presence of glucose increased by 17-fold under moderately hypoxic conditions compared to the levels produced under normoxic conditions. Under moderately hypoxic conditions acetaldehyde levels did not correlate with the expression of ADH1 and ADH2, genes catalyzing the oxidation of ethanol to acetaldehyde, or PDC11, the gene catalyzing the oxidation of pyruvate to acetaldehyde but correlated with the expression of down-stream genes ALD6 and ACS1. Our results highlight a problem where indiscriminate use of azoles may influence azole susceptibility and lead to the development of cross-resistance. Despite clinically successful treatment leading to relief of symptoms, colonization by C. albicans strains is persistent within APECED patients. Microevolution and point mutations that occur in strains may lead to the development of azole-resistant isolates and metabolic changes leading to increased production of carcinogenic acetaldehyde.

Autoimmuunipolyendokrinopatia-kandidiaasi-ektodermidystrofia (APECED, APS I) on autoimmuunitauti, joka johtuu autoimmune regulator (AIRE)-geenin mutaatiosta. Valtaosa APECED-potilaista kärsii suun ja ruokatorven kroonisesta kandidoosista varhaisesta lapsuusiästä saakka. Infektion aiheuttaa yleensä Candida albicans ja monella potilaalla vuosikymmenien altistus hiivalääkkeille on johtanut kliinisen ja mikrobiologisen resistenssin kehittymiseen. APECED-potilaiden suun krooniseen kandidoosiin liittyy lisäksi lisääntynyt suusyöpäinsidenssi. Tämän tutkimuksen ensisijainen tarkoitus oli tutkia pitkäaikaisen atsoli-sienilääkkeiden käytön vaikutusta suun kroonista kandidoosia sairastavien APECED-potilaiden C. albicans-kantojen atsoliresistenssimekanismeihin, ja sokerimetaboliaan sekä tutkia niitä sääteleviä molekyylitason mekanismeja, Ensimmäisessä osatyössä selvitimme flukonatsoli-mikonatsoli ristiresistenssin esiintymistä APECED-potilailta eristetyillä C. albicans-kannoilla. Flukonatsoli on yleisesti käytössä oleva systeeminen hiivainfektiolääke ja mikonatsoli on suun kandidoosin hoitoon tarkoitettu paikallishoitolääke. Kaikista niistä kannoista, joiden herkkyys flukonatsolille oli vähentynyt, 16%:lla oli herkkyys vähentynyt myös mikonatsolille. Matalimmat kantojen kasvua estävät mikonatsoli-pitoisuudet (MIC-arvot) korreloivat paitsi flukonatsolin, myös laajakirjoisempien ja uudempien vorikonatsolin ja posakonatsolin MIC-arvojen kanssa. Havaitsimme myös merkittävän positiivisen korrelaation mikonatsolin käyttövuosien sekä kaikkien atsolien MIC-arvojen välillä mukaan lukien sellaiset, joille potilaat eivät olleet altistuneet. Toisen osatyön tarkoituksena oli määrittää ovatko APECED-potilaat jatkuvasti kolonisoituneet samoilla C. albicans-kannoilla tehokkaasta hiivalääkityksestä huolimatta vai infektoituvatko he aina uudestaan uusilla kannoilla. Lisäksi halusimme selvittää atsoliresistenssiin johtaneita genomitason muutoksia. Kannat tyypitettiin käyttäen MLST-menetelmää ja tulostemme mukaan kliinisesti tehokkaasta hoidosta huolimatta potilaita kolonisoivat samat tai geneettisesti läheiset kannat vuodesta toiseen. Toisaalta kukin potilas oli kolonisoitunut omalla yksilöllisellä kannallaan. Analysoimme kantojen CDR1 ja CDR2 -resistenssigeenien lähetti-RNA-ekspression Northern blotting-menetelmällä, vastaavien proteiinien tuotannon western blotting-menetelmällä ja sekvensoimme atsoli-resistenssille keskeiset TAC1- sekä ERG11-geenit. Pääasiallinen molekyylitason resistenssiin johtava mekanismi aineistossamme oli ns. TAC1-geenin gain-of-function-mutaatiot, jotka aiheuttivat resistenssiin vahvasti liitettyjen CDR1 ja CDR2-geenien yliekspressoitumisen. Useilla kannoilla havaittiin myös pistemutaatioita resistenssiin liitetyssä ERG11-geenissä. Kolmannessa osatyössä analysoimme APECED-potilailta eristettyjen C. albicans-kantojen kykyä tuottaa karsinogeenista asetaldehydiä ja vertasimme tuloksia suusyöpä- sekä kontrollipotilailta eristettyjen kantojen asetaldehydi-tuotantoon. Asetaldehydi on karsinogeeninen mikrobien alkoholifermentaation ja -metabolian tuote, joka on yhdistetty yläruoansulatuskanavien syöpiin. Hiivoilla asetaldehydi on pyruvaattia asetyylikoentsyymi-A:ksi katalysoivan pyruvaatti bypass-reitin sivutuote. Tulostemme mukaan APECED-potilailta eristetyt kannat tuottavat mutageenisiä pitoisuuksia asetaldehydiä glukoosin (100mM, 18g/l) läsnä ollessa. Kyseiset pitoisuudet olivat merkittävästi suurempia kuin kontrolli- ja suusyöpäpotilailta eristettyjen kantojen tuottamat pitoisuudet. Kaikki tutkimuksen kannat tuottivat mutageenisiä pitoisuuksia asetaldehydiä alkoholi-inkubaatiossa (11mM). Tutkimuksessa käytettyjä glukoosipitoisuuksia tavataan tavanomaisissa elintarvikkeissa ja käytetyt etanolipitoisuudet vastaavat syljen etanolimäärää kohtuullisen alkoholin nauttimisen jälkeen. Tuloksemme osaltaan selittävät ruokavalion sokereiden ja alkoholinkäytön merkitystä karsinogeneesissä. Neljännen osatyön tarkoitus oli tutkia kasvuolosuhteiden merkitystä C. albicans-kantojen asetaldehydituotantoon. Tarkoituksena oli myös selvittää eri pyruvaatti-bypass-reitin säätelyyn osallistuvien geenien osuutta tässä. Asetaldehydiä muodostui glukoosin läsnä ollessa vähähappisissa olosuhteissa yli 17-kertaisesti verrattuna aikaisempiin huoneilmassa mitattuihin arvoihin. Vähähappisissa olosuhteissa asetaldehydipitoisuudet eivät korreloineet etanolin hapettumista asetaldehydiksi katalysoivien ADH1- ja ADH2-geenien tai pyruvaatin hapettumista asetaldehydiksi katalysoivan PDC11-geenin ekspression kanssa, mutta korreloivat asetaldehydin jälleenmetaboloitumista säätelevien ALD6 ja ACS1-geenien kanssa. Tuloksemme osoittavat, että myös paikallisesti annosteltavien atsolisienilääkkeiden runsas käyttö voi johtaa C. albicans-kantojen atsoliherkkyyden vähenemiseen sekä ristiresistenssin kehittymiseen. Kliinisesti tehokkaasta lääkehoidosta huolimatta C. albicans-kantojen kolonisaatio näyttäisi APECED-potilailla olevan pysyvää. Mikroevoluutio sekä pistemutaatiot johtavat atsoli-resistenttien kantojen kehittymiseen ja sekä sellaisiin muutoksiin hiivojen metaboliassa, jotka saattavat johtaa lisääntyneeseen karsinogeenisen asetaldehydin muodostumiseen.