Pre-eclampsia : The role of soluble VEGF receptor-1 and related anti-angiogenic factors beyond

Pre-eclampsia is a pregnancy complication that affects about 5% of all pregnancies. It is known to be associated with alterations in angiogenesis -related factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF). An excess of antiangiogenic substances, especially the soluble receptor-1 of VEGF (sVEGFR-1), has been observed in maternal circulation after the onset of the disease, probably reflecting their increased placental production. Smoking reduces circulating concentrations of sVEGFR-1 in non-pregnant women, and in pregnant women it reduces the risk of pre-eclampsia. Soluble VEGFR-1 acts as a natural antagonist of VEGF and placental growth factor (PlGF) in human circulation, holding a promise for potential therapeutic use. In fact, it has been used as a model to generate a fusion protein, VEGF Trap , which has been found effective in anti-angiogenic treatment of certain tumors and ocular diseases. In the present study, we evaluated the potential use of maternal serum sVEGFR-1, Angiopoietin-2 (Ang-2) and endostatin, three central anti-angiogenic markers, in early prediction of subsequent pre-eclampsia. We also studied whether smoking affects circulating sVEGFR-1 concentrations in pregnant women or their first trimester placental secretion and expression in vitro. Last, in order to allow future discussion on the potential therapy based on sVEGFR-1, we determined the biological half-life of endogenous sVEGFR-1 in human circulation, and measured the concomitant changes in free VEGF concentrations. Blood or placental samples were collected from a total of 268 pregnant women between the years 2001 2007 in Helsinki University Central Hospital for the purposes above. The biomarkers were measured using commercially available enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). For the analyses of sVEGFR-1, Ang-2 and endostatin, a total of 3 240 pregnant women in the Helsinki area were admitted to blood sample collection during two routine ultrasoundscreening visits at 13.7 ± 0.5 (mean ± SD) and 19.2 ± 0.6 weeks of gestation. Of them, 49 women later developing pre-eclampsia were included in the study. Their disease was further classified as mild in 29 and severe in 20 patients. Isolated early-onset intrauterine growth retardation (IUGR) was diagnosed in 16 women with otherwise normal medical histories and uncomplicated pregnancies. Fifty-nine women remaining normotensive, non-proteinuric and finally giving birth to normal-weight infants were picked to serve as the control population of the study. Maternal serum concentrations of Ang-2, endostatin and sVEGFR-1, were increased already at 16 20 weeks of pregnancy, about 13 weeks before the clinical manifestation of preeclampsia. In addition, these biomarkers could be used to identify women at risk with a moderate precision. However, larger patient series are needed to determine whether these markers could be applied for clinical use to predict preeclampsia. Intrauterine growth retardation (IUGR), especially if noted at early stages of pregnancy and not secondary to any other pregnancy complication, has been suggested to be a form of preeclampsia compromising only the placental sufficiency and the fetus, but not affecting the maternal endothelium. In fact, IUGR and preeclampsia have been proposed to share a common vascular etiology in which factors regulating early placental angiogenesis are likely to play a central role. Thus, these factors have been suggested to be involved in the pathogenesis of IUGR. However, circulating sVEGFR-1, Ang-2 and endostatin concentrations were unaffected by subsequent IUGR at early second trimester. Furthermore, smoking was not associated with alterations in maternal circulating sVEGFR-1 or its placental production. The elimination of endogenous sVEGFR-1 after pregnancy was calculated from serial samples of eight pregnant women undergoing elective Caesarean section. As typical for proteins in human compartments, the elimination of sVEGFR-1 was biphasic, containing a rapid halflife of 3.4 h and a slow one of 29 h. The decline in sVEGFR-1 concentrations after mid-trimester legal termination of pregnancy was accompanied with a simultaneous increase in the serum levels of free VEGF so that within a few days after pregnancy VEGF dominated in the maternal circulation. Our study provides novel information on the kinetics of endogenous sVEGFR-1, which serves as a potential tool in the development of new strategies against diseases associated with angiogenic imbalance and alterations in VEGF signaling.

Tässä väitöskirjatyössäni selvitimme Helsingin Naistenklinikalla vuosina 2001 2007 otetuista veri- ja istukkanäytteistä raskausmyrkytykselle ominaista istukan poikkeavaa verisuonikasvua ja verisuonen sisäpinnan, endoteelin, toimintahäiriötä. Tutkimusta varten etsimme varhais- ja keskiraskaudessa sikiön mahdollisten kehityshäiriöiden havaitsemiseksi järjestettävien ultraääniseulontatutkimusten yhteydessä kerätystä laajasta verinäytepankista sekä raskausmyrkytystä että yleisesti tunnetuista syistä riippumatonta ja varhaisessa vaiheessa raskautta ilmenevää sikiön kasvunhidastumaa poteneet naiset noin kahden vuoden aikaväliltä. Valitsimme löytyneelle aineistolle myös verrokkipotilaat. Tarkastelimme verisuonten uudiskasvua estävien sekä endoteelin toimintaa häiritsevien merkkiaineiksi tutkimuksen valitsemiemme tekijöiden pitoisuusvaihtelua raskausmyrkytyksen ennustajana ensimmäisen raskauskolmanneksen lopulla ja toisen kolmanneksen alussa otetuissa verinäytteissä. Lisäksi selvitimme, voisiko näitä merkkiaineita käyttää myöhemmin puhkeavan raskausmyrkytyksen ennustamiseen. Raskausmyrkytykseen sairastuu noin 5 % odottavista äideistä. Siihen on todettu liittyvän seikkoja, jotka muistuttavat metabolista oireyhtymää, tärkeintä sydän- ja verisuonisairauksille altistavaa oirekokonaisuutta. Raskausmyrkytyksen sairastaneilla naisilla onkin kaksinkertainen riski kuolla metabolisen oireyhtymän tunnusomaisiin sairauksiin, kuten sepelvaltimo- ja sokeritautiin, myöhemmin elämässään. Ennaltaehkäisevää tai parantavaa hoitoa ei raskausmyrkytykselle ole, ja sen syy on edelleen avoin. Vain istukan poistuminen johtaa lopulta oireiden helpottamiseen. Raskausmyrkytykseen sairastuneella istukan heikentyneeseen toimintaan liittyy kohdun verisuonten tavanomaista huonompi kehitys jo alkuraskaudessa. Lisäksi äidin endoteelisolujen toiminta myös muualla elimistössä on häiriintynyt. Täten väitöstutkimukseni kohdentuikin keskeisimpään verisuonten kasvua ja toimintaa säätelevistä tekijöistä, verisuonten endoteelikasvutekijään (VEGF), ja sen liukoiseen reseptoriin (liukoinen VEGFR-1), joka sitoo veressä kiertävää VEGF:ää. Verisuonten poikkeavan uudiskasvun yhteydessä on näiden tekijöiden tuotanto toisiinsa nähden epätasapainossa. Raskausmyrkytyksessä istukan erittämän liukoisen VEGFR-1:n tuotanto on havaittu kiihtyneeksi, ja sen pitoisuudet sekä lapsivedessä että äidin veressä ovat vastaavasti merkittävästi kohonneet terveisiin äiteihin verrattuna. Yhtenä väitöskirjatutkimukseni tärkeimmistä tavoitteista oli selvittää biokemiallisia ennustetekijöitä raskausmyrkytyksen kehittymiselle. Tällaisen työkalun löytyminen antaisi mahdollisuuden tunnistaa ne naiset, joita raskausmyrkytys jatkossa uhkaa. Tutkimuksen perusteella totesimmekin, että kohonnut liukoisen VEGFR-1:n pitoisuus äidin verenkierrossa ennustaa myöhempää raskausmyrkytystä jo toisen raskauskolmanneksen alussa, raskausviikoilla 16-20. Se on täten varteenotettava ehdokas etsittäessä merkkiainetta, jolla raskausmyrkytystä voitaisiin tehokkaasti ennustaa. Alkuraskauden verinäytteistä määritettiin myös muita endoteelisolujen toimintaan epäsuotuisasti vaikuttavia tekijöitä, kuten endostatiinin ja angiopoietiini-2:n pitoisuuksia. Raskausmyrkytysriskin tunnistava merkkiaine voisi osaltaan toimia lähtökohtana uusien diagnostisten menetelmien kehittämiselle. Sen lisäksi, että liukoisen VEGFR-1:n määrät olivat selkeästi suuremmat naisilla, joille myöhemmin kehittyi raskausmyrkytys, havaitsimme että myös verenkierron endostatiini- ja angiopoietiini-2 -taso oli heillä terveisiin naisiin nähden kohonnut. Yhdistämällä näistä merkkiaineista kaksi pystyttiin riskiä arvioimaan yhä paremmin. Tupakoivilla äideillä raskausmyrkytyksen todennäköisyys on aiempien tutkimusten mukaan merkittävästi tupakoimattomia naisia pienempi. Tutkimuksessamme tarkasteltiin siten tupakoinnin vaikutusta liukoisen VEGFR-1:n esiintymiseen raskaana olevien naisten veri- ja istukkanäytteissä, joskaan toteutetussa koeasetelmassa ei havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa tupakoivien ja tupakoimattomien naisten välillä. Tutkimus auttaa kuitenkin osaltansa selvittämään yleisiä VEGF -kasvutekijäperheen välittämiä tupakoinnin verisuonivaikutuksia. Viimeisin osa tutkimusnäytteistä kerättiin aikasarjana joko suunniteltujen raskaudenkeskeytysten tai keisarinleikkausten yhteydessä liukoisen VEGFR-1:n biologisen puoliintumisajan määrittämistä varten. Istukan poistuessa myös liukoisen VEGFR-1:n lähde poistuu, jolloin sen puoliintumisaika voidaan märittää varsin luotettavasti. Totesimme, että tämä merkkiaine eliminoitui kaksivaiheisesti ja että sen puoliintumisajat olivat samankaltaisia kuin vertailuna sekä myös aiemmin istukkahormoonille (hCG) mitatut. Istukan poistuttua todettiin samalla myös vapaan VEGF:n pitoisuuden normalisoituvan kun se raskauden aikana oli liukoisen VEGFR-1:n vaikutuksesta lähes mittaamattoman matala. Näitä tuloksia voidaan mahdollisesti hyödyntää tutkittaessa jatkossa mm. verisuonisairauksien ja syövän syntyä.