The effects of organic environmental toxicants on hard tissue formation in developing tooth : An in vitro study in mice

Dioxins are organic toxicants that are known to impair tooth development, especially dental hard tissue formation. The most toxic dioxin congener is 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Further, clinical studies suggest that maternal smoking during pregnancy can affect child s tooth development. One of the main components of tobacco smoke is the group of non-halogenated polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), a representative of which is 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA). Tributyltin (TBT), an organic tin compound, has been shown to impair bone mineralization in experimental animals. In addition to exposure to organic toxicants, a well-established cause for enamel hypomineralization is excess fluoride intake. The principal aim of this thesis project was to examine in vitro if, in addition to dioxins, other organic environmental toxicants, like PAHs and organic tin compounds, have adverse effects on tooth development, specifically on formation and mineralization of the major dental hard tissues, the dentin and the enamel. The second aim was to investigate in vitro if fluoride could intensify the manifestation of the detrimental developmental dental effects elicited by TCDD. The study was conducted by culturing mandibular first and second molar tooth germs of E18 NMRI mouse embryos in a Trowell-type organ culture and exposing them to DMBA, TBT, and sodium fluoride (NaF) and/or TCDD at various concentrations during the secretory and mineralization stages of development. Specific methods used were HE-staining for studying cell and tissue morphology, BrdU-staining for cell proliferation, TUNEL-staining for apoptosis, and QPCR, in situ hybridization and immunohistochemistry for the expressions of selected genes associated with mineralization. This thesis work showed that DMBA, TBT, TCDD and NaF interfere with dentin and enamel formation of embryonic mouse tooth in vitro, and that fluoride can potentiate the harmful effect of TCDD. The results suggested that adverse effects of TBT involve altered expression of genes associated with mineralization, and that DMBA and TBT as well as NaF and TCDD together primarily affect dentin mineralization. Since amelogenesis does not start until mineralization of dentin begins, impaired enamel matrix secretion could be a secondary effect. Dioxins, PAHs and organotins are all liposoluble and can be transferred to the infant by breast-feeding. Since doses are usually very low, developmental toxicity on most of the organs is difficult to indentify clinically. However, tooth may act as an indicator of exposure, since the major dental hard tissues, the dentin and the enamel, are not replaced once they have been formed. Thus, disturbed dental hard tissue formation raises the question of more extensive developmental toxicity.

Dioksiinit ovat orgaanisia ympäristömyrkkyjä, joiden tiedetään vaikuttavan epäsuotuisasti hampaan kehitykseen. Hammaskiilteen kehityshäiriöitä on todettu etenkin korkeille myrkkypitoisuuksille altistuneilla lapsilla. Toisaalta aikaisemmassa kliinisessä tutkimuksessa jopa äidinmaidon kautta saadun dioksiinialtistuksen ja lasten hampaiden kiillevaurioiden välillä vallitsi tilastollisesti merkitsevä yhteys. Lapset voivat altistua ravinnon välityksellä myös monille muille myrkyllisille yhdisteille. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli osoittaa kokeellisesti, että dioksiinien lisäksi myös muilla orgaanisilla, rasvaliukoisilla ympäristömyrkyillä, kuten polysyklisillä aromaattisilla hiilivedyillä (PAH-yhdisteillä) ja orgaanisilla tinayhdisteillä, on haitallisia vaikutuksia hampaan kovakudosten, hammasluun ja kiilteen, kehitykseen. PAH-yhdisteet ovat yksi tupakansavun pääkomponenteista ja tupakoivien äitien maidossa onkin osoitettu merkittävästi suurempia PAH-yhdistepitoisuuksia kuin tupakoimattomien. Kliinisten tutkimusten mukaan äidin tupakointi raskauden aikana saattaa pienentää lapsen hampaiden kokoa. Orgaanisen tinayhdisteen, tributyylitinan (TBT), on osoitettu häiritsevän luun mineralisaatiota koe-eläimillä. Euroopan komission tilaamassa raportissa riski erityisesti lasten altistumiselle korkeille orgaanisten tinayhdisteiden pitoisuuksille arvioitiin suureksi. Orgaanisten ympäristömyrkkyjen lisäksi fluori suurena annoksena häiritsee tunnetusti kiilteen mineralisoitumista. Toisena tavoitteena olikin tutkia fluorin ja myrkyllisimmän dioksiinin, 2,3,7,8-tetraklooridibentso-p-dioksiinin (TCDD), mahdollista yhteisvaikutusta hampaan kovakudoshäiriöiden synnyssä. Tutkimus suoritettiin altistamalla hiiren kehittyviä hampaita tutkituille yhdisteille elinviljelmässä. Väitöskirjatutkimukseni osoitti kokeellisesti, että myrkyllinen PAH-yhdiste, dimetyylibentso[a]antraseeni (DMBA) ja TBT häiritsevät hammasluun ja kiilteen muodostusta, ja että TBT-altistus muuttaa kovakudosten muodostuksessa tärkeiden geenien ilmentymistä. Tulokset näyttivät myös, että TCDD:llä on yhdessä fluorin kanssa suurempi vaikutus hammasluun ja kiilteen muodostuksen häiriintymiseen kuin kummallakaan aineella yksinään. Orgaanisten myrkkyjen ympäristössä vallitsevat pitoisuudet voivat siis yhdessä fluorin kanssa olla riittäviä kovakudosvaikutuksen ilmenemiseen. Hammasluun ja kiilteen kehityksenaikaiset häiriöt ovat pysyviä. Hammas voikin toimia ympäristömyrkkyaltistuksen bioindikaattorina. Hampaan kovakudosten muodostumisen häiriintyminen voi herättää kysymyksen tietyn myrkyn laajemmastakin kehityksellisestä toksisuudesta.